NYT 1185-2006马流行性感冒诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1185—2006马流行性感冒诊断技术Diagnostic techniques for eguine influenza2006-07~10 发布2006-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1185—2006前言马流行性感冒(Equine Influenza)是由正黏病毒科流感病毒属 A 型流感病毒(亚型 1:H7N7,亚型 2:H3N8)引起马的一种急性呼吸道传染病,临床表现为高热、有刺耳的干咳,鼻孔有黏性脓性分泌物。最典型的特点是在易感马群中传播极快，发病率极高,有时可高达100%。本病无年龄、性别、品种差异。一年四季均可发生。对未受母源抗体保护的幼驹较多地发生致死性感染。病马退热后较长时间带毒和排毒，成为威胁马属动物的传染源。我国将该病定为二类动物疫病,本标准病毒抗原的 ELISA检测方法等同采用 OIE《哺乳动物、禽蜜蜂 A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(2000 版)推荐的方法,其他诊断方法等效采用 OIE推荐的方法。本标准的附录 A、附录 B、附录 C 和附录 D 为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：王玉东、相文华、郑增忍、杨建德、刘俊辉、曲志娜、王永玲。I NY/T 1185—2006马流行性感冒诊断技术1范围本标准规定了马流行性感冒的临床诊断、病原分离、血凝试验(HA)、病毒抗原的 ELISA 试验、血凝抑制试验(HI)的技术要求。本标准适用于马流行性感冒的流行病学调查、临床诊断和实验室诊断。。2临床诊断2.1询问易感马发病状况及免疫情况，当出现发热、刺耳的干咳、鼻流黏性脓性分泌物时，怀疑发生本病。2.2轻症型：此种病型常见,主要表现轻度咳嗽,流水样或浆液性鼻汁，体温稍升高或正常，眼结膜潮红，一一般约经一周后康复。2.3重症型：患马突然发病,表现精神委顿、食欲减退、全身无力、不愿活动。体温升高至39.5℃,稽留3d～4 d,发热的同时出现阵发性咳嗽,初为干咳,后为湿咳,有冷空气或尘埃刺激时会出现剧烈咳嗽。初期流浆液性或黏液性鼻汁，后期为黄白色脓性鼻汁。鼻黏膜潮红、眼结膜充血肿胀，流泪,分泌物增多。呼吸加快、有的出现心率不齐,四肢下端或腹下发生浮肿。多为良性经过,约经一周后恢复正常。2.4在临床诊断不能确诊或必须进行确诊试验时,要进行实验室诊断。3 实验室诊断3.1病原鉴定3.1.1材料准备器材：酶标仪、96孔V型或U型微量反应板、微量移液器、恒温培养箱、孵化器、恒温水浴锅、普通冰箱、低温冰柜、台式离心机、1mL注射器和5mL注射器、棉拭子、青霉素瓶等。试剂:甘油、乙醚、过碘酸钾(KIO4)、青霉素、链霉素、丁胺卡那霉素。0.1 mol/L.pH 为7.2 的磷酸盐缓冲液(PBS),配制方法见附录 A。1%鸡红细胞悬液:配制方法见附录B。马流感抗原(全病毒或吐温80/乙醚处理过的病毒):病毒处理方法见附录D。马流感标准亚型阳性血清、标准阴性血清。 10 日龄～11 日龄 SPF鸡胚。3.1.2 病原分离样品采集应在临床症状出现后立即采集样品，包括鼻咽拭子和气管冲洗物。取样时须将棉拭子经前侧鼻道伸人鼻咽部并停留10 s,蘸取呼吸道黏液,取出后立即放人盛有 1mL～2mL运输培养液的青霉素瓶中。该运输培养液是含有40%甘油的pH为7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。样品在4℃时可保存1d～2d,若要保存较长时间,则应在－60℃以下温度保存,运送样品时应该加冰块冷藏。样品处理-次只能处理一份样品,从鼻咽拭子中挤出的液体,加人青霉素1000 IU/mL～2000IU/mL,链霉一素 1mg/mL～2mg/mL。如果样品污染严重,应加丁胺卡那霉素等敏感抗生素,加2000 IU/mL。加完抗生素后，放在冰上静置30min，然后以1500r/min离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，去1 NY/T 1185--2006除细菌和杂质,经检测无菌后,滤液用于 SPF鸡胚接种。未用完的样品放回－60℃以下冰箱保存。样品接种孵化至10日龄～11日龄的 SPF鸡胚将气室部用碘和酒精消毒后,在壳上打一个孔。每份样品接种3枚鸡胚,每胚尿囊腔内接种0.2mL。用石蜡封孔,鸡胚放置34℃～35℃孵化器内继续孵化3d。收获尿囊液将鸡胚转到 4℃冰箱中放置 4 h 或过夜,使鸡胚死亡,使在收获时减少出血。先将蛋壳表面消毒,用注射器收获尿囊液,用 1%的红细胞悬液检测尿囊液的血凝活性(HA)。每胚收获的尿囊液要分开冷冻保存。种毒选择与保存为避免缺陷型病毒粒子产生干扰，要将接种物先作10倍、100倍、