SN_T 3402-2012两系水稻品种真实性与纯度鉴定 DNA分析法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3402—2012两系水稻品种真实性与纯度鉴定DNA分析法Identification genuineness and purity of two-line rice varietiesusing DNA analysis method2013-07-01实施2012-12-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3402—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、安徽省农业科学院水稻研究所、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局本标准主要起草人：杨剑波、姚剑、陆徐忠、倪金龙、陈雪娇、郑海松、李云飞、张萍、张健、从夕汉刘海珍、张小娟、马琳、朱金国。 SN/T3402—2012两系水稻品种真实性与纯度鉴定DNA分析法1 范围本标准规定了水稻光、温敏核不育系及两系杂交水稻品种真实性和纯度的SSR标记分析方法。本标准适用于水稻光、温敏核不生和纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1水稻光、温敏核不育系ricephotoperiod/thermo-sensitivegenicmale sterile line家不育特性选育的水稻雄性不育系，其在短日低温条件下表又称两系不育系，利用水稻的光、温敏现为雄性可育，可以繁殖种子；在长日高温条件下表现为雄性不育，可以用于制种。3.2两系杂交水稻留two-linehybridric利用水稻光、温敏核不育系与恢复系杂交产生的FI代。3.3两系水稻two-line-rice本标准中将两系杂交水稻和两系不育系统称为两系水稻3.4微卫星标记simplesequencerepeat（SSR）marker由几个核苷酸（一般为2～6个）为重复单元的多达几十至几百次的串联重复；由于基本单元重复次数的不同，进而形成SSR座位的多态性；根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性3.5标准样品standardsample经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖物种而言，一般为种子。4原理我国生产上两系水稻的不育基因主要为光敏核不育基因pms1、pms3以及温敏核不育基因tms5，其对应的特征性分子标记为pms1-S1、pms3-C1、tms5-S2，根据这些特征性标记可判断是否为两系水稻；同时利用水稻基因组中大量存在的SSR单元在不同品种间重复次数的差异，通过SSR多态性分1 SN/T3402-2012城析，区别不同水稻品种（组合）；根据SSR标记具有共显性的特点和F1杂交种子具有双亲等位标记互补带型的特性，可判断受检种子是否为杂交种。将光、温敏核不育基因的特征性鉴定与SSR分析相结合，构成了本标准所指的两系水稻品种真实性和纯度鉴定的DNA分析方法。5.仪器5.1PCR扩增仪。5.27高速冷冻离心机：最大离心力≥12000g。5.3日电泳检测系统，垂直电泳系统、水平电泳系统。5.4微量移液器规格分别为2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调。5.5低温冰箱：最低温度一20℃。5.6凝胶成像系统。5.7高压灭菌锅120℃±2℃。电子天平：精确度0:001g。5.85.9恒温水浴锅温控精确度土1℃。脱色摇床等5.10磁力搅拌器。5.11微波炉。5.12胶片观察灯。5.135.14酸度计精度士0:01pH。6试剂和溶液6.1试剂6.1.1六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。6.1.2主羟甲基氨基甲烷碱（Tris-Base)。6.1.3七二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H,O)。6.1.4浓盐酸氧氧化钠。6.1.5氯化钠.7主氯甲烷。6.1.8鼻戊醇。6.1.9鼻丙醇6.1.10无水艺醇。6.1.11液氮。6.1.12TaoDNA聚合酶及其配套缓冲液。6.1.13四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTPs。6.1.14限制性内切酶AccI及其配套缓冲液。6.1.15硼酸6.1.16去离子甲酰胺。6.1.17琼脂糖，6.1.18溴酚蓝6.1.19二甲苯氰FF。丙烯酰胺。6.1.202 SN/T3402—20126.1.21甲叉双丙烯酰胺。6.1.22尿素。6.1.23N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED)。6.1.24过硫酸铵。6.1.25冰醋酸。6.1.26硫代硫酸钠。6.1.27硝酸银。6.1.28甲醛溶液：