SC_T 7224-2017鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7224—2017鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP）检测方法Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationfor spring viraemia of carp virus2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部5发布 SC/T 7224—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：全国水产技术推广总站、深圳市检验检疫科学研究院、深圳出人境检验检疫局、暨南大学食品安全与研究院。本标准主要起草人：郑晓聪、贾鹏、李清、王津津、余卫忠、何俊强、于力、刘莹、兰文升、史秀杰、刘、秦智锋、石磊。I SC/T7224—2017鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法1范围本标准给出了鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP)检测的技术原理，规定了试剂和材料、器材和设备、操作步骤及结果判断本标准适用于鲤春病毒血症病毒的初筛检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T15805.5鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV）GB/T18088出人境动物检疫采样SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV酶：AMV逆转录酶（avianmyelobastosisvirusreversetranscriptase）Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）［BstDNAPolymerase(largefragment)」DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA：乙二胺四乙酸（ethlenediamine tetraacetic acid）PBS：磷酸盐缓冲溶液（phosphatebuffersaline)RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增（reversetranscriptionloop-mediated isothermal amplifica-tion)SVCV：鲤春病毒血症病毒（springviraemia ofcarpvirus）4技术原理本标准根据SVCV(参见附录A中A.1)基质蛋白基因，设计了4条引物（参见附录B)特异性识别基因组中的6个区域。在AMV酶和链置换Bst酶的作用下，63℃恒温扩增60min，即可实现SVCV核酸扩增。而后，在扩增反应后加人显色液，即可通过观察颜色变化判定结果。5试剂和材料5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。5.2DEPC水：配制方法见附录C中C.1或购买商品化试剂。5.3磷酸盐缓冲液（PBS）：配制方法见C.2或购买商品化试剂。5.4Trizol试剂：商品化试剂，4℃保存。5.5三氯甲烷：分析纯，避光常温保存。5.6异丙醇：分析纯，使用前预冷至一20℃。1 SC/T7224—20175.7引物：SVCV- FIP: 5-CGCTTGTTCCTAGAACCTTTGTAATTTTTCCCTTGAAGACGATGTCAG3，40umol/L备用；SVCV-BIP: 5- TACAGATTGATCATGTTCCGTTGTGTTTTTGGAATACAAGGCCGACC3，40umol/L备用；SVCV-F3:5-GGATATACAATTGGACACC-310umol/L备用;SVCV-B3:5-ACAACTTCCTTGCACCTT-3,10μmol/L备用。5.810×ThermoPol缓冲液：商品化产品，内含0.2mol/LTris-HCl、0.1mol/L氯化钾、0.1mol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。5.9dNTPs:含dATP、dTTP、dCTP、dTTP各10mmol/L。5.10甜菜碱：浓度5mol/L，配制方法见C.3，一20℃保存，避免反复冻融。5.11硫酸镁（MgSO）：浓度100mmol/L，一20℃保存。5.12AMV酶：酶浓度5U/μL，—20℃保存，避免反复冻融。5.13Bst酶：酶浓度8U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。5.14矿