SC 3020-2004水产品中已烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法.pdf

ICS, 67.050B 50中华人民共和国水产行业标准SC/T 3020—2004水产品中已烯雌酚残留量的测定酶联免疫法Determination of diethylstilbestrol residues in fishery productsEnzyme linked immuno sorbent assay2004-01-07发布2004-03-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T前言本标准的附录 A和附录 B均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。本标准主要起草人：艾晓辉、刘长征、邹世平、徐忠法、李荣。1i!1!1 SC/T 3020—2004水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法1 范围本标准规定了水产品中已烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于水产品肌肉中已烯雌酚的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，加入已烯雌酚标准或样品溶液、已烯雌酚酶标记物、已烯雌酚抗体后，已烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗体的结合位点。结合的已烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测，吸收光强度与样品中的已烯雌酚浓度成反比,按校正曲线定量。4试剂和材料本标准所用试剂除标明外,其他均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB/T6682一级水标准。4.1 叔丁基甲基醚:色谱纯。4.2 石油醚。4.3二氯甲烷。4.4甲醇：色谱纯。4.5氢氧化钠:1 mol/L。4.6磷酸:6 mol/Lo4.720%甲醇的20 mmol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH8.5),40%、70%、80%的甲醇溶液，此溶液现用现配。4.867mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2):9.61g磷酸氢二钠,1.79g磷酸二氢钠溶解于蒸馏水,定容至1 000 mL,此溶液现用现配。4.9己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒,参见附录 A。5 仪器与设备5.1酶标仪:波长 450 nm。5.2离心机:转速4000 r/min。5.3氮吹仪。5.4电热恒温水浴锅。5.5高速匀浆机。1 SC/T 3020—20045.6Cls固相提取柱:长6.5 cm,内径0.7cmo5.7 固相萃取器。5.8微型漩涡混合仪。5.9振荡器。5.10 微量加样器:20 μL、50 μL、100 μL、250 μL、1 000 μL。5.11微量多通道加样器：50μL、100μLo6样品处理6.1试样提取取出鱼、虾、蟹、鳖等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀,置冰箱中冷冻备用。将样品解冻,取5g(精确到0.01g)样品于匀浆机的玻璃管中,加10mL67mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2),充分匀浆,称取3g(精确到0.01g)勾浆组织于20mL玻璃离心管中,加人8mL叔丁基甲基醚，强烈振荡20min，4000r/min离心10min,转移出上清液至20 mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次提取的醚相合并，70℃水浴蒸发至干。取 70%的甲醇1mL溶解于燥的残留物,加3mL石油醚洗涤甲醇溶液,漩涡混合1min,4 000r/min离心1min,吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氮甲烷溶解，加1mol/L氢氧化钠溶液3mL，漩涡振荡后静置,取出上层氢氧化钠溶液,加人6mol/L.磷酸300μL中和提取液，用Cig固相提取柱进一步纯化。6.2样品纯化将Cis固相提取柱垂直固定,用3mL无水甲醇洗涤柱子,再用2 mL20%甲醇的20 mmol/LTris缓冲液(pH8.5)平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000μL微量加样器全部加人柱中，过柱,然后用2mL20%甲醇的20mmol/LTris缓冲液（pH8.5)洗涤柱子,接着用3mL40%的甲醇洗涤柱子,弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以干燥柱子。用2mL80%的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴/s左右，可用固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加人2mL水,取20μL进行酶联免疫测定。7 酶联免疫测定检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好(参见附录