SN_T 2867-2011饲料中鱼源性成分定性检测方法 PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2867—2011饲料中鱼源性成分定性检测方法PCR 方法Qualitative identification of fish derived material in feedstuff--PCR method2011-05-31 发布2011-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2867—2011前言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张舒亚、熊炜、蒋静、潘良文。 SN/T 2867--2011饲料中鱼源性成分定性检测方法PCR 方法1范围本标准规定了饲料中鱼源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%。本标准适用于饲料中鱼源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1　饲料　采样SN/T 1193基因检验实验室技术要求3缩略语PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应DNA(deoxyribonudeic acid）):脱氧核糖核酸4原理利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用核苷酸序列测定进行确证。5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1检测用引物包括：a）正向引物:5-TAA gAg ggC Cgg TAA AAC TC-3b）反向引物:5-gTg ggg TAT CTA ATC CCA g-35.2十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。5.3三羟甲基氨基甲烷(Tris）。5.4乙二胺四乙酸(EDTA)。5.5氯化钠(NaCl)。5.6三氯甲烷(氯仿)。5.7 异丙醇。1 SN/T 2867—20115.8无水乙醇。5.9 70%乙醇。5.10裂解液:1%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）,0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)[Tris-:三（羟甲基)氨基甲烷},0.7 mol/L氯化钠,0.01 mol/L EDTA(pH8.0乙二胺四乙酸）。5.11氯化钠溶液（1.2 mol/L）。5. 12 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0),1 mmol/L EDTA(pH 8. 0)。5.13分子量标准品（100 bp～2000 bp）。5.14 Taq DNA 聚合酶。5.15dNTPs(脱氧核苷三磷酸）:dATP(脱氧腺苷三磷酸）、dTTP(脱氧胸苷三磷酸）、dCTP(脱氧胞苷三磷酸）、dGTP(脱氧鸟苷三磷酸）。5.16 琼脂糖:电泳纯。5.17溴化乙锭（或用其他代替品）5.1810×PCR缓冲液：100 mmol/L氯化钾160 mmol/l.硫酸铵安.20 mmol/L 硫酸镁,200 mmol/LTris-HCl (pH 8.8),1%Triton X-100,1 mg/mlBSA(牛血:清蛋白)。5.19电泳缓冲液:Tris 54 g，硼酸 27.5.5mol/LFDTA、Tris-HCl(pH 8.0)20 mL,加蒸馏水至4[1000mL;使用时10倍稀释。5.20加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，10%（质量浓度）蔗糖水溶液。6仪器设备6.1PCR 仪。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度6.3恒温水浴锅。6.4高速离心机。6.5微量移液器（2.5 μL、20 μL,200 μL,1 o0dμL)6.6研钵及粉碎装置。6.7涡旋振荡器。6.8 pH计。6.9 电泳仪。6.10紫外检测仪。6.11天平：感量0.01g。试样选取与制备按照GB/T14699.1采样，将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。8 检验步骤8.1样品的总DNA提取称取适量样品（饲料粒度为100目时最少称取50mg；60目时至少称取100mg;20目时至少称取200 mg)于1.5gmL离心管中，加人600μL～800 μL裂解液,65℃ 30 min以上，期间不时振荡混匀；2 SN/T 2867—201112000g离心5min;转移上清液于洁净离心管中,加400μL三氯甲烷+十异戊醇（24+1），混匀；12000g离心5min,取上清液;加0.8倍体积异丙醇,沉淀;12000g离心5min,