SBT 10463-2008猪肺炎支原体检验方法.pdf

ICS 11. 220B 41SB备案号：24730—2008中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T 10463—2008猪肺炎支原体检验方法Methods for the detection of mycoplasmal pneumonia of swine2008-12-01实施2008-07-03 发布发布中华人民共和国商务部 SB/T 10463--2008前 言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。本标准由中华人民共和国商务部屠宰技术鉴定中心负责起草。本标准主要起草人：赵志云、金社胜、郑志明。 SB/T 10463-2008猪肺炎支原体检验方法1范围本标准规定了猪支原体肺炎的检验方法。本标准适用于生猪屠宰过程中猪支原体肺炎的实验室检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1猪支原体肺炎 mycoplasmal pneumonia of swine由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae）感染引起猪的一种接触性传染病。以气喘和咳嗽、患猪长期生长缓慢发育不良、肺门淋巴结呈髓样肿胀,淋巴组织显著增生为特征。4设备和材料4.1 过滤器:300 nm孔径。4.2剪刀、镊子。4.3 锥形瓶:1 000 mL。4.4均质器或灭菌乳钵。4.5注射器:1 mL(具0.1 mL刻度)、5 mL(具 0.1 mL刻度)。4.6 量筒:250 mL。4.7平Ⅲ:直径90 mm。4.8 试管:16 mmX160 mm。4.9吸管:10 mL(具 0.1 mL刻度)。4.10滤纸、漏斗、纱布、棉花、玻璃棒、胶塞。注：以上试验器材,在试验前应灭菌处理。4.11生化培养箱：36℃士1℃。4. 12恒温水浴箱。4.13高压灭菌器。4.14厌氧罐：（厌氧培养箱）。4.15载玻片。4.16酒精灯。4.17电子天平：感量 0.1g。4. 18光学显微镜：物镜10×～100×。4.19pH 试纸、接种环等。 SB/T 10463-20085 培养基和试剂5.1姬姆萨氏染色液（见附录 A)。5.2　瑞氏染色按 GB/T 4789.28一2003中 2.6的方法进行。5.3伊红美蓝染色（见附录A）。5.4Goodwin 氏等复合液体培养基（见附录 A)。5.5Goodwin氏等复合固体培养基（见附录A)。5.6 Hanks 液(见附录 A)。6检验程序病理组织1病理学检查分离培养组织触片、肉眼检查组液体培养固体培养织病变姬姆萨氏染色T+结果判断显微镜观察姬姆萨氏染色显微镜观察结果判断结果判断图 1 猪肺炎支原体检验程序7 检验用病料肺脏、肺门淋巴结。8 检验步骤8. 1 病理学检查8.1.1 肉眼检查肺的病变部位主要见于心叶、尖叶、中间叶及瞩叶的前缘。常呈间质性肺炎病变，两侧肺病变大致对称。病变部界限明显，质地坚实，呈胶样浸润半透明状态。切面湿润、平滑，像嫩肉样（即“肉变”）。严重的病例病变部颜色加深，呈淡紫红色、深紫色或灰白色、灰红色，至后期半透明状态减轻，坚韧度增加，似胰脏组织(即“胰变）。肺门和纵淋巴结肿大，呈灰白色、水肿。切面湿润稍外翻，边缘有时可见轻度充血。8.1.2触片及染色检验样品制成触片，自然干燥,用甲醇固定 2 min～5 min,再以 pH7.2 的磷酸盐缓冲液稀释 20 倍的姬姆萨氏染色液染色3h，水洗后立即用丙酮浸染一次，然后镜检。2 SB/T 10463—20088.1.3镜检猪肺炎支原体呈紫红色，多数在细胞外，偶见在嗜中性白细胞的胞浆内。呈球状、环状、椭圆形或两极形、直杆或弯杆状，单个或群集。8.2分离培养8.2.1 分离将病肺组织用 Hanks 液洗去血液和组织碎片,取病肺 25 g 加人到 225 mL Goodwin 等氏复合液体培养基中，用均质器 8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min,或用乳钵加灭菌砂磨碎。用灭菌过滤器过滤，去除杂质。8.2.2 培养移取10 mL滤液转种于100 mL Goodwin 等氏复合液体培养基中，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中37℃士1 ℃、含 5%～10% CO2 条件下,培养 3 d～7 d,观察其产酸和浊度情况,培养基由红变黄,呈轻微混浊。取培养液划线接种于 Goodwin 等氏固体培养基平板，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中 37℃士1℃，培养,在固体培养基上生长