SN_T 3278-2012风信子黄腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3278—2012风信子黄腐病菌检疫鉴定方法Detection and Identification of Xanthomonas hyacinthi(Wakker) Vauterin et al.2013-05-01实施2012-10-23发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3278--2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：邵秀玲、尼秀媚、厉艳、甘琴华、赵文军、吴兴海、王英超、纪瑛 SN/T 3278—2012风信子黄腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了风信子黄腐病菌的常规检测鉴定方法、实时荧光PCR检测方法、结果判定和菌株保存等方法。本标准适用于百合科风信子属等植物种球及产品中风信子黄腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3风信子黄腐病菌基本信息学名 Xanthomonas hyacinthi (Wakker) Vauterin et al.英文名称 Bacterial wilt of hyacinth属于原核生物界（Procaryotae）薄璧细菌门（Gracilicutes）暗细菌纲（Scotophobia）假单胞菌目(Pseudomonadales)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)黄单胞菌属（Xanthomonas）。病原菌分布、寄主范围、危害、传播途径等资料参见附录A。4方法原理经现场查验，实验室用显微镜、定量PCR仪等仪器设备对样品进行检测，根据病原菌的菌落特征，菌体形态、生理生化特性及致病性测定和分子生物学检测结果进行判定。5仪器设备和用具5.1仪器设备电子天平（感量0.0001g）、植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机（12000r/min）、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、定量PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、Biolog微生物鉴定系统、电动搅拌器等。5.2　用具培养血、试管、可调式微量进样器（2μL、10 μL、20 μL、100 μL、200μL、1000 μL）及其枪头、研钵、离心管（1.5 mI、1.0 mL）、PCR 管(0.2 μL）、量筒、烧杯等。1 SN/T 3278--20126 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。培养、鉴定风信子黄腐病菌所用培养基中的试剂及其配方参见附录B。7检测鉴定7.1现场检疫7.1.1样品查验数量按SN/T1157的规定执行。7. 1.2 症状观察被侵染的球茎可产生扭曲的叶，叶片上可发展狭长的水浸状不规则条斑，后变褐色，花茎也可被侵染并引起枯萎。横切叶片、花梗和鳞茎病部，可见维管束有大量淡黄色粘性细菌溢出，风信子叶片、球茎危害症状参见附录 A。7.2实验室检测鉴定7.2.1样品初筛通过肉眼或显微镜观察，对危害症状不明显的潜在感染可直接通过分子生物学检测进行样品初筛，初筛阳性的样品需完成7.2.2～7.2,8的检测。危害症状明显的样品需进行7.2.2～*.2.7的检测，30℃以上的培养条件可提高症状出现的速度。实验室检测鉴定流程图参见录C7.2.2 病原菌的分离与培养取可疑植物组织，75%酒精销薪，无菌水洗3次后，放在无菌的裁玻片上用无菌的玻璃棒研碎，滴一滴无菌水于研碎的病组织上。静置2min～5min后，用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在NA培养基平板上划线，28℃至少培养24 h～48h后，观察菌落生长情况，进行菌种纯化。7.2.3菌落特征纯化的病原菌在NA培养基上培养，可生成圆形单菌落，表面隆起，不透明，光滑.菌落粘稠，呈典型的黄单孢菌属的黄色，颜色随菌落的厚度增加而加深，菌落特征图参见附录D。7.2.4形态特征按GB/T4789.28中规定的方法或商业染色产品进行革兰氏与鞭毛染色，显微镜观察菌体形态。风信子黄腐病菌菌体呈长直杆状，末端圆形，有一根极生鞭毛，大小约为（0.3um～0.4 μm）×（1.4 um～6.0 μm）,菌体扫描症状图片参见附录 D。7.2.5生理生化革兰氏染色阴性。呼吸代谢，永不发酵。氧化酶反应阴性或弱。接触酶阳性。在弱缓冲的培养基上，可利用很多碳水化合物产生少量的酸，但不从鼠李糖、菊根粉、卫矛醇、阿东醇、肌醇或柳醇产酸，从山梨醇很少产酸