SN_T 4648-2016柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T橘黑斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Guignardia citricarpa Kiely2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局显查真伪 SN/T 4648—2016前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国江西出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王卫芳、李红叶、王兴红、吕文刚、何瑞芳、何日荣、黄河、吴品珊、陈雪娇。 SN/T 4648—2016柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了柑橘黑斑病菌（Guignardia citricarpaKiely）的检疫鉴定方法。本标准适用于柑橘（柑、橘、柠檬、橙、柚、金橘、积)水果和苗木生产、加工及进出口贸易中柑橘黑斑病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1806出境柑橘鲜果检疫规程3柑橘黑斑病菌的基本信息学名：GuignardiacitricarpaKiely（1948）（中文名：柑橘球座菌）无性型：Phyllostictacitricarpa(McAlpine)Aa(1973)异名：PhomacitricarpaMcAipine（1899）Phoma citricarpa McAlpine (1899) var. citricarpaPhoma citricarpa var. mikan Hara (1925)Phyllostictina citricarpa (McAlpine)Petr.(1953)分类地位：在分类上隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），叶点霉科（Phyllostictaceae），球座菌属（Guignardia）。柑橘黑斑病菌的寄主范围、地理分布、为害症状参见附录A，病菌的培养性状和形态特征图参见附录B和附录C,柑橘黑斑病菌与近似种比较参见附录D。4检疫鉴定原理以寄主上病果的症状特点、病菌的形态学特征或病菌的形态学特征及培养性状作为柑橘黑斑病菌的检疫鉴定依据。5仪器及用具5.1仪器设备体视显微镜、生物显微镜、电子天平（感量0.1g）、电磁炉、高压灭菌器、超净工作台、培养箱、冰冻切片机。5.2实验用具样品袋、保鲜袋、标签、定性滤纸、手持放大镜、酒精灯、载玻片、盖玻片；火焰消毒的接种针、镊子、解1 SN/T 4648—2016剖刀及打孔器（直径4mm）、培养Ⅲ（直径9cm）、烧杯（1000mL）、量筒（1000mL）、三角瓶（250mL）、玻棒、铝锅（直径24cm）。6试剂和培养基6.1试剂1%次氯酸钠（NaOC1)溶液、70%乙醇、蒸馏水、无菌水。6.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)和燕麦琼脂培养基（OA），培养基配方与配制方法见附录E。7检疫鉴定方法7.1产地检疫在柑橘成熟期、采果期、加工期于出口基地及加工包装厂抽取未采摘、已采摘、已加工、已包装的橘果，检查果皮是否有柑橘黑斑病症状，病斑上是否有黑色小颗粒状分子孢子器（症状描述和图片参见A.4、附录B），抽取有可疑症状（包括有明显和无明显分子孢子器）的病果样品带回实验室作进-步检验，抽样与取样按照SN/T1806进行。7.2实验室检验7.2.1症状检查在体视显微镜下观察记录病斑的细微特征，包括病斑的形态、大小和颜色、病斑上聚生的分生孢子器，并拍摄数码照片。7.2.2切片检查如果病果果皮上的病斑有明显的黑色小颗粒状分生孢子器，则切取病斑，置于体视显微镜下细致观察病斑的形态、颜色及大小，然后对病斑组织进行徒手切片或冰冻切片，将切片置于生物显微镜下观察病菌的形态学特征。7.2.3病斑分离培养切取如果病果果皮上的病斑未形成黑色小颗粒状分生孢子器，则切取病斑，按～进行分离培养。组织表面消毒用解剖刀将病健交界组织切成4mm×4mm进行表面消毒（70%乙醇浸泡1min或1%Na0Cl溶液浸泡1min，无菌水冲洗3次），最后用无菌滤纸吸干表面水分，作为分离培养材料备用。分离培养将表面消毒好的病组织块移至PDA平板上，在27℃/24h全黑暗下培养。培养第5d，用无菌接种针从菌落边缘挑取菌丝块移至新的PDA平板上纯化培养10d，将纯菌株置于4℃下保存待用。2 SN/T 4648—20167