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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2662—2010进出口动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的检测方法酶联免疫吸附法Determination of zearalanol residues in foodstuffs of animal originfor import and export-Enzyme linked immunosorbent assay2010-11-01发布2011-05-01实施K中华人民共和国发布安国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2662—2010前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑文杰、赵卫东、刘炬、贺艳、朱梦、万宇平、冯才伟、赵正苗。 SN/T 2662--2010进出口动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的检测方法酶联免疫吸附法1 范围本标准规定了动物性食品中玉米赤霉醇残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、羊肉和牛奶中玉米赤霉醇残留量的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验用水规格和试验方法3方法提要鲜奶样品酶解后稀释即可用间接竞争性酶联免疫吸附法进行检测；肉类样品用乙腈提取玉米赤霉醇，萃取净化后，用间接竞争性酶联免疫吸附法进行检测。4试剂和材料除另有要求外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 乙腈。4.2 三氯甲烷。4.3正已烷。4.4葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶。4.5玉米赤霉醇酶联免疫试剂盒(参见附录 A）。5仪器和设备5.1均质器。5.2 离心机。5.3旋涡混合器。5.4酶标仪。5.5氮吹仪5.6温育培养箱。5.7 单道微量加样器:50 μL,100 μL,20 μL～200 μL,200 μL～1 000 μL。5.8²多通道微量加样器：50μL～250μL可调。 SN/T 2662—20106样品制备与保存从全部原始样品取出有代表性样品约200g，将均质混匀的样品分成两等份，将分好的试样装入洁净容器，加封并做标识，在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。将试样存放于20℃中保存。7样品测定7.1.鲜奶样品取1mL新鲜牛奶到2mL离心管中，加人8 μL葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶（773U/mL），置于37℃水浴酶解2 h;取出25μL于另.2.mL.离心管中,加人975μL复溶液进行稀释,混匀;取出50μL用于分析。7.2肉类样品称取1g(精确至0.1g)样品,加人2mL去离子水;加人8μL葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶混匀,37℃水浴酶解2h;取出加人8mL乙腈振荡10min，3000r/min以上离心5min；取上清液5mL，加人2mL三氯甲烷，加入6mL正已烷，祸旋振荡10min，3000r/min以上离心5min;去除上层正已烷，取中间层吹干,加入 1 mL复溶液(见附录B中 B.2)旋涡溶解,取 200 μL到 2 mL离心管中,加人 800 μL复溶液混合,取出50μL用于分析。8测定步骤8.1试剂的制备8.1.1复溶工作液提供的复溶工作液为2×浓缩液。使用前角蒸馏水将复溶工作液稀释2倍使用。8.1.2洗涤液提供的洗涤液为20×浓缩液。使用前用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释20倍使用。8.2样品检测往酶标板里加标准品/样本50μL孔，再加人50 μL/孔的抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板,置于温育培养箱中 37℃反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4次～5次，每次浸泡10 s,拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。加人酶标二抗工作液 100 μL孔，轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板,置于温育培养箱中 37℃反应 30 min,取出重复洗板步骤。每孔加人底物 A液50μL,再加B液 50 μL,轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，于温育培养箱中 37℃避光显色15min。每孔加人浓度为2mol/L的终止液50 μL,轻轻振荡混匀。于 450 nm处测定吸光度值(OD值)（建议用双波长450/630nm检测，加人终止液后在5min内读完结果）。9结果的计算标准品和样品的百分吸光度值计算方法见式（1）：2 SN/T 2662--2010B百分吸光率：X 100%(1)B.式中:B -标准品或样品的百分吸光度值；B。—0 标准的百分吸光度值。以百分吸光度值为纵坐标，玉米赤霉醇标准溶液的浓度（ng/kg)的半对数值为横坐标绘制标准工作曲线。从标准曲线上得到试样中相应的玉米