NY_T 3074-2017牛流行热诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3074—2017牛流行热诊断技术Diagnostic techniques for bovine ephemeral fever2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T3074—2017前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：郑福英、殷宏、刘永生、宫晓炜、陈启伟、高闪电- NY/T3074—2017引言本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及附录B与《牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法》相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：殷宏、郑福英、刘志杰、陈泽、王积栋、李志、杨吉飞、高闪电地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。按NY/T543一2002《牛流行热微量中和试验》中规定的方法进行试验，可对牛流行热病毒血清抗体进行定性和定量检测。本标准中的间接ELISA方法仅可对牛流行热病毒血清抗体进行定性检测，而不能进行定量检测。因此，本标准中的间接ELISA方法不替代NY/T543一2002，两种技术可同时应用。I NY/T3074—2017牛流行热诊断技术1范围本标准规定了牛流行热的临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于牛流行热的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T543一2002牛流行热微量中和试验方法3生物安全措施进行牛流行热实验室诊断时，如病毒分离、血清处理等，按照GB19489的规定执行。4临床诊断4.1流行特点4.1.1以3岁～5岁壮年牛多发，奶牛、黄牛易感性最强。4.1.2通过媒介昆虫叮咬呈病毒血症的病牛，再叮咬易感牛传播扩散，多发生于夏末秋初蚊虫活跃的多雨季节。4.1.3呈跳跃式传播，疫区与疫区之间交叉存在无病的清洁区。4.1.4有一定的周期性，间隔时间为1年～7年不等。4.1.5发病率高、死亡率低，在没有继发感染的情况下病牛多为良性经过。4.2临床症状4.2.1病牛表现为突发高热，体温高达39.5℃～42.5℃，持续2d～3d。4.2.2病牛流泪、畏光，眼结膜充血；有鼻炎性分泌物；口腔发炎、流涎；呼吸急促、困难。4.2.3高热期病牛食欲废绝，反台停止，瘤胃胀、蠕动停止，便秘或腹泻。4.2.4妊娠母牛可发生流产、死胎。4.2.5乳牛的产乳量明显降低，甚至停止。4.3剖检病变4.3.1主要病变在肺部，急性死亡的病例可见有明显的肺间质气肿，有些病例可见肺充血与水肿。4.3.2淋巴结充血、肿胀；真胃、小肠和盲肠呈卡他性炎症和渗出性出血。4.4结果判定符合4.1流行特点，病牛出现4.2临床症状和4.3剖检病变，判为疑似牛流行热。5实验室诊断5.1样品采集与储存5.1.1样品的采集1 NY/T3074—2017选择处于发热期（体温39.5℃～42.5℃）的活畜采集样品，从其颈静脉无菌采集2管肝素抗凝血，每管5mL～6mL；另外，再采集5mL～6mL血液收集到血清管中，用于分离血清。5.1.2样品的储存样品采集后，置于冰上冷藏送至实验室。2管肝素抗凝血，1管置于4℃冷藏，另外1管冻存于一80℃。将血清管稍倾斜放于37℃温箱内，保温2h；然后，3000r/min离心10min。吸取血清，转移到另外的无菌1.5mL离心管中，冻存于一20℃。5.2器械与设备组织破碎仪、低温高速离心机、PCR热循环仪、核酸电泳仪和电泳槽、全自动凝胶成像系统、恒温培养箱、洗瓶或者洗板机、酶标仪。5.3牛流行热病毒分离与鉴定5.3.1试验材料50uL容量的微量进样器、无菌1.5mL离心管、灭菌0.01mol/LpH7.4PBS（见附录A中的A.1）、牛白细胞提取液。5.3.2样品处理取出4℃冷藏的肝素抗凝血，用商品化牛白细胞提取液从5mL抗凝血中提取白细胞，用0.5mL灭菌pH7.4PBS悬浮，反复冻融3次，保存于一80℃备用。5.3.3样品接种初代接种.1将上述制备的白细胞悬液5000r/min离心5min，用微量进样器吸取50μL上