SN_T 2582-2010产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2582—2010产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法Detection of aflatoxigenic strains of Aspergillus by PCR2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局微码防动 SN/T2582-2010前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、浙江省疾病预防控制中心、浙江大学。本标准主要起草人：程洁、王志刚、应盛华、张晓峰、方莹、李可、何永强、董强、帅江兵、顿玉慧张俊彦。 SN/T 2582--2010产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法1 范围本标准规定了食品、粮食和饲料中产黄曲需毒素的黄曲和寄生曲莓的PCR检测方法。本标准适用于食品、粮食和饲料中产黄曲霉毒索的黄曲霉和寄生曲的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。月是注日期的引扇文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T4789.15食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数GB/T4789.16食品卫生微生物学检验常见产建菌的签定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1035出口食品中主主要产毒真菌检验方法WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用3缩略语下列缩略语适用于本文件3.1aflRaflatoxinbiosynthesisregulatorygene产黄曲霉毒素调节基因。3. 2DEPC diethypyrocarbonat焦碳酸二乙酯。3. 3dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷酸三磷酸。3. 4ITS internal transcribed spacer内部转录间隔区。3. 5omt-1sterigmatocystin o-methyltransferase gene柄曲霉素转甲氧基酶基因。3.6PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。1 SN/T 2582—20103.7ver-l1versicolorin A dehydrogenase gene杂色曲霉素A脱氢酶基因。4.生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施见WS/T230中污染的预防和控制规定。6原理目前已知产黄曲霉毒素真菌主要是黄曲霉和寄生曲霉。本方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因：调控基因aflR，柄曲霉素转甲氧基酶omt-1和杂色曲霉素A脱氢酶ver-1的有无来判断待检菌株是否能够产生黄曲霉毒素，按照黄曲霖毒素生化合成过程，只要缺少上述三个关键基因之均不能合成黄曲舞毒素。另外使用真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列作为阳性参标可判断提取的DNA模板和PCR反应是否合适。7试剂和材料除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T6682规定的-级水。7.1萨氏培养液：见附录A第A.1章。7.2DNA提取溶液：见附录A第A.2章。7.3引物：见表1。表 1 引物序列产物名称引物名称引物长度/bp产物长度/bp上下游引物序列19ITS15*-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ITS60019ITS45-TCCTCCGCTTATTGATATGC-324AfIR F5-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3afR97924AlIR R5-CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3255-GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC-3797om1-1OmtF OmtR255*-GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG-3255′-GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGGTGGT-3*452ver-1VerF VerR235-CCGCAGTCAATGGCCATGCAGCG-3*7.4 dNTP:dATP.dTTP.dCTP、dGTP.2 SN/T2582—20107.510XPCR缓冲液。TaqDNA聚合酶。7. 67.7琼脂糖：电泳纯。7.8溴化乙锭。7.9分子量标记：100bpI.adderDNAMarker。电泳缓冲液：见附录A第A.3章。7.107. 11加样缓冲液：见附录A第A.4章。7.1225mmol/L氯化镁。7.13酚-三氯甲烷-异