SN_T 3731.6-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第6部分：鹧鸪成分检测　 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3731.6--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法Identification of poultry ingredient in food and feed-Part 6 : Detection of alectoris ingredient-Real-tiem PCR method2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局甜涂层查真伪 SN/T 3731.6-2013前言SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分：第1部分：鹤鹑成分检测　PCR法；-第2部分：鹅成分检测　PCR法；-第3部分：鸽子成分检测　实时荧光PCR法；—-第 4部分：火鸡成分检测　实时荧光 PCR法;第5部分：鸭成分检测PCR法；-第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3731的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：曹琛福、宗卉、杨俊兴、卢体康、花群义、秦智锋、吕建强、叶奕优、张彩虹、陶虹、韩建勋。 SN/T 3731.6--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光 PCR 法1范围SN/T3731的本部分规定了食品及饲料中鹧鸪（石鸡）成分检测的实时荧光PCR方法。本部分适用于食品及饲料中鹧鸪（石鸡）成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 PCR real time PCR在 PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)ROX:6-羧基-X-罗丹明(6-carboxyl-X-Rhodamine)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)5　方法提要样品经研磨混匀后，提取 DNA，以DNA为模板，采用鹧鸪线粒体 CoI基因特异性检测引物和探针1 SN/T 3731.6—2013进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在鹧鸪成分。6 试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。6.1检测用引物(对)序列和探针鹧鸪成分扩增引物和探针详见表1。表1 试验用引物和探针名称序列(5′-3)目的基因鹧鸪成分5端引物F: 5-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3鹧鸪成分3端引物R:5-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3鸪线粒体 CoI 基因鹧鸪成分探针P: 5-FAM-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-ECLIPSE-36.2 试剂6.2.1裂解液:1% CTAB;0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0); 0.7 mol/L NaCl:0.01 mol/I EDTA(pH8.0)。6.2.2DNA 聚合酶。6.2.32×荧光 PCR缓冲液。6.2.4硫酸镁。6.2.5dNTP混合液。6.2.6ROX染料。6.2.7三氯甲烷。6.2.8异丙醇。6.2.975%乙醇。6.2.10双蒸水。7仪器和设备7.1离心机（最大离心力大于12000 g）。7.2微量移液器(100 μL～1 000 μL,20 μL～200 μL,2 μL～20 μL,0.5 μL～10 μL)。7.3实时荧光 PCR仪。7.4恒温水浴锅。7.5天平：感量0.001g和0.1g。7.6涡旋振荡器。7.7pH计。8检验步骤8.1样品制备