SN 1151.3-2002斑节对虾杆状病毒（MBV）诊断方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.3—2002斑节对虾杆状病毒(MBV)诊断方法Test method for penaeus monoden-type baculovirus (MBV)2002-11-25 发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1151.3—2002前言本标准是非等效采用OIE的《水生动物健康手册》2000年版的检疫规程以及国内在该领域的研究成果的基础上制定的。本标准的附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高隆英、刘、江育林、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。I SN/T 1151.3—2002斑节对虾杆状病毒(MBV)诊断方法1范围本标准规定了用组织学方法和 PCR技术检测斑节对虾杆状病薪(MBV)的检测方法。本标准适用于斑节对虾杆状病(MBV)病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO）3696：1987)3试剂和材料3.1本标所用水应符含GB/T 6682一1992中一级水的规格。所用的试剂配方见附录A。3.2 dNTP(含 dCTP,dGTP,dATP.dTTP 各 10 mmol/L)3.3引物可以选用两对引物。其序列如下：p35 : 5-AC(TC)-TA(TC)-GTG-TCA-GAC-AAC-AAA-TA(TC)-TAC-AAA-3p36 :5-GG(TC)-GCG-TC(TG)-GG(TC)-AA(TC)-TT(AT)-AC(TC)-TT(AG)-AA-3*该引物用于扩增病毒多角体蛋白基因中的647bp片段。括号内的碱基表示：在该位置上这几种碱基都可以用，并且在合成引物时应是这几种不同引物的混合物。GC21PF: 5-AAC-CTT-CGG-CCT-TCC-ATT-3GC21PR :5-AAT-CGA-ACG-GCC-TTA-GCA-3该引物用于扩增病毒 DNA 的1017 bp片段。3.4Taq酶(见附录 A)一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5无水乙醇分析醇,使用前预冷到一20℃。3.6矿物油不含DNA和RNA酶。3.7 PCR扩增仪3.8电泳仪3.9电泳槽3.10离心机3.11微量移液器3.12紫外透射仪3.13旋涡振荡器3.14恒温培养箱 SN T 1151.320023.15普通冰箱3.16超低溢冰箱3.17显微镜3.18常规组织切片用具4组织切片法4.1采样处理把Davidsons(见附录A)固定液直接注射到肝胰腺中杀死对虾。用尖头的外科剪打开头胸部和腹部靠近背脊中线的表皮，可使固定液更加容易渗人（切去腹部）。如果是整只虾（或去掉腹部的头胸部），就放在固定液中固定24h～48h，然后移到70%乙醇中保存。在转移到70%乙醇后，可用蘸满70%乙醇的布块或纸片包裹襄固定样品，然后装在密封的塑料袋中转运。4.2组织切片在开始组织学处理之前，要把固定的对虾切成2mm²～3mm²的组织块脱水，先用梯度酒精逐步脱水。 50%(20 min)→70%(20 min)-→80%(20 min)→90%(20 min)→95%(20 min)-100%(15 min)-100%(15min）。然后透明：二甲苯-酒精（1：1)2h-二甲苯2h→二甲苯1h。再将样品放人56℃液态石蜡透蜡2h～3h，然后包埋在石蜡中，切成 4 um～6μm厚的切片，放人 45℃～50℃温水中，贴片(60C烘3 h)。室温在25℃以下时，必须将切片放置温箱内预热后，立即入二甲苯中脱蜡；或者将二甲苯稍加温而脱蜡，两法均可使切片脱蜡彻底。脱蜡后，用无水乙醇洗去二甲苯成分，为防止脱片，再进行梯度乙醇至水。4.3组织学染色选用HF（苏木精-伊红）（见附录A)染色检测肝胰腺细胞、肠道上皮细胞或肠管腔内球状的MBV包涵体。染色过程为1：2稀释的苏木精染液（1min～3 min)→1%的酸性酒精[75%酒精含1%（盐酸)HCI7(10s、2min)→伊红染液（3min)伊红液过后，切片须经95%及无水乙醇进行分化和脱水，否则将无法透明。5聚合酶链反应(PCR)法5.1DNA抽提在盛有粪便或肝胰腺样品的1.5mI.微量管中加人含50mmol/L氮化钾（KCl）、10mmol/LTrisHClpH8.3、1%SDS和80μ