SNT 2482-2010马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2482-2010马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法Identification of potato witches broom phytoplasma2010-07-16实施2010-01-10 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T前本标准的附录 A和附录 B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：王秀芬、赵文军、刘伟、彭金火、牟海青、周铭、朱水芳本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2482—2010马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法范围1本标准规定了马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定方法本标准适用于所有进境种薯、商品薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定。2原理2.1学名和分类地位学名:Potato witches’ broom phytoplasma缩写:PWB分类地位：细菌界（Bacteria），硬壁菌（Firmicutes）r柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科(Aeholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），三叶草丛族组(Clover proliferation group,16Sr MI) 。其他资料参见附录 A。2.2鉴定原理马铃薯丛枝植原体的分子生物学特性为本标准鉴定方法的主要依据。3仪器和用具3.1仪器设备：PCR 仪、超净工、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10000g）、pH计、水浴锅、振荡器等。3.2 用具;可调移液器(0 μL～20 μL、20 μL200 μL/200 μl～100o μL)及相关吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管(0.2mL）、量筒、烧杯、镊子等。4 试剂4.1研磨液磷酸氢二钠（Na²HPO4）o.i mol/L磷酸二氢钠(NaH,PO)0.03 mol/LEDTA10 mmol/L(pH8. 0)蔗糖10%（质量浓度）PVP-402%（质量浓度）调整 pH 至 7.6,然后过滤除菌。使用前加入0.15%(质量浓度)牛血清白蛋白(BSA)和1mmol/L抗坏血酸维生素C。4.2CTAB缓冲液CTAB2%（质量浓度）Tris-HCl100 mmol/L(pH8. 0)20 mmol/L(pH8. 0)EDTA氯化钠(NaCI)1. 4 mol/LPVP-401%（质量浓度） SN/T 2482—20104.3其他试剂苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、TaqDNA聚合酶、10XPCR 缓冲液、dNTP 液(2.5 mmol/L dATP,dTTP,dCTP,dGTP)。5 检疫鉴定5.1　DNA 提取大约 0.3g组织(叶柄、叶脉、茎)在 3 mL预冷研磨液中研磨,将粗汁液转移至 2 mL微量离心管中。4℃下4 500r/min离心5min。将悬浮液转至新的2mL离心管中。4℃下13000 r/min离心15min。去掉上清液。在750 μL预热（55℃）CTAB缓冲液中悬浮沉淀［少量 CTAB缓冲液（如100 uL)更易悬浮沉淀，然后加人剩余的 CTAB缓冲液（如 650 αL)］。55℃下孵育 30 min，间歇颠倒混匀。离心管在冰上冷却30 s。加人750μL三氯甲烷：异戊醇（24：1体积比），涡旋振荡。4℃或室温下 13 000 r/min离心4 min。小心将上面水相转至一个新的 1.5 mL离心管中。加人 1体积预冷异丙醇，涡旋振荡。冰上孵育 4min后4℃或室温下13000 r/min离心10min。去掉上清液。用500μL70%(体积分数)冷乙醇洗涤DNA沉淀，4℃或室温下13000 r/min离心1min。空气干燥DNA沉淀。用 20 μL灭菌蒸馏水悬浮沉淀。55 ℃下孵育离心管 10 min 有助于 DNA再悬浮。一20 ℃短期贮存或-80℃长期贮存。注：也可采用商品试剂盒提取。5.2 引物序列引物采用植原体16SrDNA（参见附录B)通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2。引物序列见表1。表 PCR检测的引物产物/bp引物名称引物序列5-3P1AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT1800P7CGTCCTTCATCGGCTCTT通用引物R16F2nACGACTGCTAAGACTGG1 251R16R2TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG5.3巢式 PCR用引物P1/P7进行第1轮PCR。反应体系见表2。反应条件为：94℃/5min;94℃/30s,53℃/