SN_T 4737-2016猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测方法Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component inpigs and their derived products2017-07-01实施2016-12-12 发布中华人民北和国发布)国家质量监督检验检疫总局刮涂激宽精 SN/T 4737—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所、中华人民共和国山东出人境检验检疫局，本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、李奎、潘登科、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、刘丹丹、仇松寅。 SN/T 4737---2016猪及其产品中特定转基因成分实时定量 PCR检测方法1范围本标准规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。本标准适用于转脂肪酸去饱和酶基、转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。APPA:植酸酶(Phytase)MSTN:肌肉生长抑制素(Myostatin)PCR:聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)sFat-l:w-3 脂肪酸去饱和酶基因(omega-3 fatty acid desaturase)TE:Tris-HC1.EDTA 缓冲液防污染措施4猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5实时定量PCR试验5.1主要仪器5.1.1实时荧光定量PCR仪。5.1.2超净工作台。5.1.3消毒灭菌锅。5.1.4#核酸蛋白分析仪。5.1.5高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。5.1.6低温冰箱,冷藏冷冻冰箱。 SN/T 4737—20165.1.7纯水器，双蒸水器。5.1.8漩祸震荡器。5.1.9微量进样器:2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。5.2主要试剂5.2.1实验用水：符合GB/T 6682中一级水的规格。5.2.2TagDNA聚合酶,三氯甲烷，异丙醇，异戊醇,70%乙醇,TE缓冲液,50倍 TAE电泳浓缩缓冲液,细胞裂解缓冲液,蛋白酶K,醋酸钠（NaAc)。药品及试剂配制方法见附录 A。5.3引物和探针按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，配制成10pmo1/μL用于PCR检测，扩增序列参见附录 B。表 1检测转基因猪内外基因所需的引物序列被检测基因「基因来源引物序列探针序列备注5GAAGGTTCAGGTTTACTCACG3ISCCCAGCGGAAAACGGSus 32M猪内源内参照5TCAGCAAATCAATTTCAATCTG3AAAGCCAA35AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCT35TGCAGGTCAATTCTMSTN基因MSTN内源5CAGACTGCCTTGGGAAAAGC3MGB3敲除猪检测5TGTTCGTTGGCAGGTTTTAC35TGAATGAAGCACGCA转植酸酶APPA外源5AGATGGCTGGCAACTAGAAG3TACCGGC3基因猪检测转w-3 脂5TGTACGAGGCTGATGAATGG35TGTGTCCAATCCGAGTsFat-1外源肪酸去饱和酶5TGTCCGTCTGTGATATGGTG3CCATAGTAACGA3基因检测5.4试验步骤5.4.1样品采集采集动物的组织块作为检测样品，将其放入无菌Eppendorf管中，编号备用。采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。5.4.2样品存放对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.4.3样品核酸的提取取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm²），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1mL的细胞裂解缓冲液勾浆至不见组织块，转人1.5 mL离心管中，加人蛋白酶 K（20 mg/mL）和胰 RNA酶（20mg/ml)各5μL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转人37℃水浴12h～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12 000r/min离心5min，取上清液转人另一离心管中。