NY_T 561-2015动物炭疽诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 561-2015代替NY/T561—2002动物炭疽诊断技术Diagnostic techniques for animal anthrax2015-10-09发布2015-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 561---2015前 創言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替NY/T561—2002《动物炭疽诊断技术》，与NY/T561—2002相比，主要技术变化如下：增加了规范性引用文件（见2）；增加了生物安全要求（见3）：增加了炭疽细菌学检查操作流程（见5）；增加了病料标本运输（见6.1.3）；增加了PCR鉴定试验（见6.6)；增加了陈旧动物病料和环境标本的细菌学检查（见7)；修改了病料标本采集（见6.1.1和6.1.2)；修改了细菌学检查的综合报告（见6.7）；修改了皮张标本取样和皮张抗原的制备方法（见8.1和8.3）；删除了雷比格尔氏荚膜染色法和荧光抗体染色法；删除了青霉素串珠试验；删除了非皮张类标本的沉淀试验检查。本标准与世界动物卫生组织OIE编著《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2012年第7版）中有关炭疽的诊断技术基本一致。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：军事医学科学院军事兽医研究所。本标准主要起草人：冯书章、祝令伟、刘军、郭学军、孙洋、纪雪、周伟。本标准的历次版本发布情况为：-NY/T561—2002。 NY/T561--2015动物炭疽诊断技术1范围本标准规定了动物炭疽芽孢杆菌的分离、培养及鉴定方法。本标准适用于动物炭疽的诊断和检疫以及环境标本中炭疽芽孢杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件国务院［2004］424号病原微生物实验室生物安全管理条例农业部[2003】302号兽医实验室生物安全管理规范农医发【2007]12号炭疽防治技术规范3生物安全要求3.1疑似炭疽病料标本的涂片、染色和镜检，以及灭活材料的PCR试验和沉淀试验操作应在BSL-2实验室进行。3.2病原分离培养操作应在BSL-3实验室进行。3.3采样过程中的个体防护按照农医发[2007]12号的规定执行，实验过程中的操作和个体防护按照农业部【2003]302号的规定执行，推荐长期从事炭疽诊断的专业人员接种炭疽疫苗。3.4所有可能受污染的物品应彻底灭菌处理，可能受污染的环境应消毒处理，灭菌及消毒方法按照农医发【2007]12号的规定执行。4材料准备4.1器材恒温培养箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、Ⅱ级生物安全柜、光学显微镜、台式离心机、CO2培养箱、PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪或紫外分析仪。4.2培养基及试剂普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、5%绵羊血液琼脂平板（或5%马血液琼脂平板）、0.7%碳酸氢钠琼脂平板、PLET琼脂平板；碱性美蓝染色液、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液、TAE电泳缓冲液、2%琼脂糖凝胶、上样缓冲液、0.5%苯酚生理盐水。配制方法见附录A。4.3诊断试剂国家标准炭疽沉淀素血清、炭疽皮张抗原、健康皮张抗原、炭疽诊断用标准噬菌体和Ⅱ号炭疽疫苗菌株。4.4实验动物体重18g～22g清洁级实验用小鼠。5操作流程炭疽细菌学检查操作流程见图1。 NY/T561—2015陈旧动物病料和环境标本新鲜疑似炭疽动物病料标本制备悬液血液涂片或组织触片染色镜检+62℃~63℃水浴15min~20 min+10倍梯度稀释1个~3个梯度，涂布涂布琼脂平板培养基PLET琼脂平板,37℃培养36h~48h★*挑取扁平、灰白色、毛玻璃样、不溶血的粗糙型大菌落噬菌体裂解试验PCR鉴定试验青霉素抑制试验判定结果，出具诊断报告图1炭疽细菌学检查操作流程6新鲜疑似炭疽动物病料标本的细菌学检查6.1病料标本采集和运输6.1.1疑似炭疽患病动物病料标本采集疑似炭疽患病动物，自消毒的耳部或尾根部静脉采血1mL～3mL，或者抽取病变部水肿液或渗出液以及天然孔流出的血性物，放置于无菌采样管中。取少许血液或组织液直接涂于载玻片上，自然干燥后火焰固定，放置于载玻片盒中。6.1.2疑似炭疽死亡动物病料标本采集疑似炭疽死亡动物，针刺鼻腔或尾根部静脉抽取血液。已经错剖的疑似炭疽动物尸体，应立即停止解剖活动，可抽取1mL～3mL血液或血性物，或者用无菌棉拭子蘸取组织切面采样，并做血液涂片或组织触片，然后立即按照农医发[2007］12号的规定处理现场。6.1.3病料标本运输病料标本的包装和运输应符合国务院[2004]424号的要求，运输时间超过1h，应在2℃～8