SN 1465-2004西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1465--2004西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法Methods of quarantine and identification of Acidovorax avenae subsp. citrulli2005-04-01实施2004-11-17 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局鸡粉 SN/T 1465—2004前言本标准的附录 A、附录 B为规范性附录,附录 C 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标推由中华人民共和国新疆出人境检验检疫局负责起草，南京农业大学参加起草。本标准主要起草人：张祥林、薛光华、胡白石、张伟、范伟功、余永杰。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1465----2004西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,简称 A.a.c)的鉴定方法。本标准适用于对瓜类植物种子中的西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。2 原理细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch)是西瓜、甜瓜等葫芦科作物上的一种危险性病害，此病的病原菌为西瓜细菌性果斑病菌[Acidovorar avenae subsp. citrulli(Schaad, Sowell,Goth,Colwell andWebb 1978) Willems,Goor,Thielemans,Gillis,Kersters and De Ley 1992 VPJ,该菌属原核生物界（Procaryotae）、薄壁菌门（Gracilicutes）、暗细菌纲（Scotobacteria）、假单孢菌科（Pseudomonadaceae）、嗜酸菌属（Acidoorar)。该病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径,以及 PCR特异性反应等特征是该检疫鉴定方法的依据。3仪器和用具3.1生物显微镜（具照相系统）。3.2超净工作台。3.3电子天平（感量1/10000)。3.4光照恒温培养箱。3.5恒温振荡培养箱。3. 6低温冰箱。3.7高压灭菌器。3.8培养皿（直径：7.5cm)。3.9恒温水浴锅（30℃～95℃）。3. 10高速冷冻离心机（18000r/min以上）。3. 11小型电动粉碎机。3. 12PCR仪。3.13电泳装置(电泳仪、水平电泳槽）。3. 14PCR 管(0.2 mL)。离心管(12 mL、2 mL、1.5 mL)。3. 153.16微量可调加样器（2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000μL)。3. 17加样器枪头(2 μL～20 μL、20 μL～~200 μL、200 μL～1 000 μL)。4主要试剂蛋白陈、琼脂粉、甘油、升汞、盐酸、次氯酸钠、二甲基对苯二胺盐酸盐、酵母膏、葡萄糖、牛肉浸膏、酚红、小碱、羧甲基纤维素、硼酸、亮甲酚蓝、溴甲酚紫、乙醇、放线菌酮、羧苄青霉素、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠(SDS)、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、溴化乙锭、TaqDNA聚合酶、磷酸氢二钾（K,HPO.）、磷酸二氢钾（KH,PO）、磷酸氢二钠(NazHPO4·12H²O)、磷酸二氢铵(NH4H²PO4）、硫酸镁(MgSO4·7H²O)、氯化钙(CaCl²·7Hz0)、氯1 SN/T 1465—2004化钠(NaCl)、氯化钾(KCI)、10 ×PCR 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L KCl)、10X dNTP 液(2.5 mmol/L dATP,dTTP,dCTP,dGTP).5检疫鉴定方法5.1种植观察将待测的瓜类种子种植于温室或实验室内的育苗钵（纸杯或塑料杯)中，每一育苗钵中种植2粒种子，每份种子样品种植5000粒左右，最低不少于3000粒种子，生长环境温度为25℃～35℃，相对湿度大于等于70%，种子出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出西瓜细菌性果斑病苗期的典型症状（见附录A），则采集可疑病株进行分离培养及常规检测，或直接用病叶提取核酸作 PCR 检测。5.2分离培养5.2.1种子中病原菌的分离培养分别称取待测瓜类种子样品各100多，分装于干净纸袋中，做好标记，供检测用。无菌操作下，将供试样品置于0.1%升汞溶液中表面消毒30 s～80 s(也可用含有效氯1%的次氯酸钠溶液表面消毒2min～4 min)，无菌水清洗三次，然后将种子移至无菌的小型电动粉碎机中，破碎种子，将处理好的种子装人一灭菌的广口瓶中，加人200mL灭菌的0.1mol/I磷酸钠缓冲液，混匀，25℃下过夜，次日用