蛋白质纯化的方法.doc

蛋白质纯化的措施、局限性及展望 姓名：杜改亮 学号： 专业：细胞生物学 摘要：相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须可以每次都能产生相似数量和质量的蛋白，反复性良好。这就规定应用适应性非常强的措施而不是用能得到纯蛋白的最佳措施去纯化蛋白。在试验室条件下的好措施却也许在大规模生产应用中失败，由于后者规定规模化，且在每日的应用中要有很好的反复性。本文综述了蛋白质纯化措施长处及局限性，以期对蛋白纯化的措施选择及整体方案的制定提供一定的指导，并提出展望。 关键词：蛋白质的纯化措施； 局限性； 展望 引言 蛋白纯化要运用不一样蛋白间内在的相似性与差异，运用多种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而运用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，运用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大体分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段重要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，规定所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的辨别率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质靠近的蛋白辨别开来，要用更小的树脂颗粒以提高辨别常用的离子互换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个原因。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐一从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 多种蛋白纯化措施及优缺陷 1.1硫酸铵沉淀蛋白 蛋白能溶于水是由于其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度尤其高或尤其低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，由于它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有助于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，清除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保留中间产物，目前蛋白质纯化多采用这种措施进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀措施仍存在某些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵同样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保留而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的措施，由于它只能到达几倍的纯化效果，而我们在到达目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 1.2离子互换色谱 这是在所有的蛋白纯化与浓缩措施中最有效措施。基于蛋白与离子互换树脂间的互相电荷作用，通过选择不一样的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子互换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子互换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子互换树脂；羧甲基用于弱的阳离子互换树脂；季铵用于强阴离子互换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子互换树脂。蛋白质由氨基酸构成，氨基酸在不一样的pH环境中所带总电荷不一样。大多数蛋白在生理pH（pH 6—8）下带负电荷，需用阴离子互换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量防止。由于在某个特定的pH下不一样的蛋白所带电荷数不一样，与树脂的结合力也不一样，伴随缓冲液中盐浓度的增长或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是变化盐浓度而不是去变化pH值，由于前者更轻易控制。在试验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子互换柱，运用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度可以中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，因此常用分步洗脱而局限性持续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子互换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较廉价。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子互换单一的措施也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化环节。 1.3亲和层析 亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。本措施存在的问题是：单抗非常昂贵，并且也需先纯化；单抗与目的蛋白结合力太强．要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也也许破坏抗体或与它们非特异结合；某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从