NY_T 572-2016兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 572—2016代替NY/T572—2002免病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法Haemagglutination and haemagglutination inhibition tests for rabbithaemorrhagic disease2017-04-01实施2016-10-26发布中华人民共和国农业部3发布 NY/T572—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替NY/T572—2002《兔出血病血凝和血凝抑制试验方法》。与NY/T572—2002相比除编辑性修改外，主要技术变化如下：修改了微量血凝试验中V型微量滴定板中加人PBS的孔数（见6.1）.修改了V型微量滴定板第11孔的加人样品（见6.4）；修改了玻片血凝法的取样方法和检测方法（见7）：参考（)IE《陆生手册》删除了微量血凝抑制试验检测免病毒性出血病病毒的方法（2002年版2.3);一增加了用于检测免病毒性出血病病毒抗体的微量血凝抑制试验（见8）。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心?本标准主要起草人：王芳、魏后军、宋艳华、范志宇、胡波、魏荣、孙映雪、徐为中。本标准的历次版本发布情况为：-NY/T5722002。I NY/T572—2016兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法1范围本标准规定了免病毒性出血病病毒血凝和血凝抑制试验方法的技术要求，本标准适用于免病毒性出血病病毒的鉴定和抗体检测。2试剂2.1PBS(0.1mol/L.pH7.0~7.2),见A.1。2.2阿氏液（Alsevers），见A.2。3材料3.1重组VP60抗原的制备见附录B。3.2免病毒性出血病死亡兔、待检兔和健康兔肝脏悬液的制备分别将肝脏剪碎，按1：10加入PBS后匀浆，再以1000×g离心30min，取上清液备用3.3抗原工作液的制备根据测定的重组VP60抗原和/或免病毒性出血病死亡免肝脏悬液的红细胞凝集效价，用PBS稀释成4个血凝单位的抗原工作液。3.41%人“0型红细胞悬液的制备取新鲜人“)”型红细胞于阿氏液中保存（置2℃～8℃可保存7d）。用时取人“（)”型红细胞以20倍量PBS混匀洗涤红细胞，400×g离心5min，弃上清，重复洗涤4次。最后一次离心前，计算红细胞悬液体积（在离心后扣减弃去上清液的体积，即为红细胞的体积）。洗涤后的红细胞用PBS配成1%悬液，置2℃~8℃备用。3.5血清及其处理3.5.1免病毒性出血病阴性血清、免病毒性出血病阳性血清及待检血清。3.5.2所有血清处理方法：取血清100μL，56℃水浴灭活30min，加人10μL人型红细胞（按照人(型红细胞与血清为1：10的比例加人），混匀，2℃～8℃作用1h，以400×g离心5min.收集上清待检。4仪器设备4.1离心机：要求最大离心力在12000×g以上。4.2温箱：（37±1)℃。4.3恒温水浴锅。4.42℃～8℃冰箱。4.5微量移液器（0.5μl10μl.2μl~20μl，20μl~200μ，100μl~1000μl）。4.6微型振荡器。5微量血凝试验(用于检测免病毒性出血病病毒抗原）5.1在96孔V型微量凝集板上，从第2孔至第10孔，每孔加人25μl.PBS。1 NY/T572—20165.2然后在第1孔、第2孔加人1：10的待检兔肝悬液25uL。5.3从第2孔开始.充分混合后用25ul移液器等量倍比稀释至第10孔.稀释后第10孔弃去25μl。5.4第11孔～第12孔加1：10的健康兔肝悬液为阴性对照。5.5每孔各加1%人)型红细胞25ul.立即置于微型振荡器上摇匀.于2℃～8℃冰箱静置45min待阴性对照孔中红细胞完全沉积后观察结果，5.6每次测定应设已知效价的免病毒性出血病死亡兔肝悬液阳性对照，方法同5.1～5.5。5.7结果判定和红细胞凝集效价表示方法如下：a）“十十十+”符号为100%凝集，无红细胞沉积b）“+++”符号为75%以上凝集，有少于25%的红细胞沉积；c）“++”符号为50%～75%凝集，有少于50%的红细胞沉积；d）+”符号为凝集的红细胞少于50%.沉积的红细胞多于50%；e）二”符号为100%的红细胞沉积。免病毒性出血病死亡兔肝悬液阳性对照凝集效价与已知效价不得相差一个滴度以上，健康免肝悬液阴性对照无凝集；被检样品出现“十十”的最高稀释度作为其凝集价，凝集价≥1：160（即第5孔）的判为阳性.如在1：（20～80)之间，定为可疑，应重复试验，重复后仍为可疑的判为阳性。6玻片血凝法（现场快速诊断，用于检测免病毒性出血病病毒抗原）取少许待检兔肝脏样品，置于清洁的载玻片上，用剪刀将肝