SN_T 4235-2015猪戊型肝炎检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4235—2015猪戊型肝炎检疫技术规范Quarantine protocol for swine hepatitis E2015-05-26 发布2016-01-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局eY刮涂层查真保 SN/T 4235—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、上海市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：鱼海琼、张强、乔彩霞、罗长保、赵吟、蔡先全、刘佩红、周锦萍、李树清、吴晓薇。一 SN/T·4235—2015猪戊型肝炎检疫技术规范1范围本标准规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本标准适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样GB/T19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。HEV:戊型肝炎病毒BSA：牛血清白蛋白HRP:辣根过氧化物酶OD值：光密度值ELISA：酶联免疫吸附试验荧光RT-PCR：实时荧光聚合酶链式反应4试剂4.1HEV阳性对照血清。4.2HEV阴性对照血清。4.3HEV抗原。4.4牛血清白蛋白。4.5HRP标记的兔抗猪IgG。4.60.01mol/LPBS缓冲液。4.7抗原稀释液（见附录A）。4.8洗涤液（见附录A）。4.9吐温-20。4.10封闭液（见附录A）。4.11显色剂（见附录A）。4.12终止液（见附录A)。4.13TRIZOL.4.14三氯甲烷。 SN/T.4235-20154.15异丙醇：一20℃预冷。4.16 0.1%DEPC水。4.1775%乙醇。4.18RNA酶抑制剂(40 U/μL)。4.19TaqDNA聚合酶(5U/μL)及相应10X缓冲液。4.20M-MLV反转录酶(200U/μL)及相应5×反转录反应缓冲液。4.21dNTP(2.5 mmol/L)。4.22MgCl2 (25. mmol/L)。5设备5.1二级生物安全柜。5.27高压灭菌锅。5.3微量移液器。5.4酶标仪。5.5·洗板机。5.6高速冷冻离心机。5.7荧光PCR仪。6临床诊断6.1流行病学戊型肝炎的流行病学特点与甲肝相似，参见B.1。6.2临床症状及病理变化猪自身感染HEV临床症状并不明显，参见B.2。6.3初步诊断根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步诊断应采集样品进行实验室检测，该病原属人畜共患病原，涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB/T19489生物安全要求进行。1实验室检测7.1酶联免疫吸附试验（间接ELISA)7.1.1原理96孔微量板的奇数列包被有戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原，偶数列则未包被。检测样品和对照样品加入到反应孔内，每个样至少加平行的两孔（一个奇数孔和一个偶数孔）。如果血清中存在特异性抗体，会形成抗原-抗体复合物。洗板后，加HRP标记的酶结合物，该酶标结合物与HEV抗原抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶复合物。洗去过剩的酶结合物，加人底物液，样品中特异性抗体的数量就会在奇数、偶数孔间出现颜色差异：如果存在抗体，加人终止液后蓝色液体会变成黄色；如果没有抗体，则无色。2. SN/T4235—20157.1.2样品采集制备按照GB/T18088，无菌操作采集动物血，每头不少于5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于一20℃。7.1.3操作步骤使用前将所有试剂平衡至室温（21士5）℃，将反应板/条做好标记，阴性对照孔A1、A2、B1、B2，阳性对照孔C1、C2、D1、D2。7:1.3.2用多通道移液器加190μL样品稀释液至所有样品孔。加10μL阴性对照至A1、A2、B1、B2孔；加10μL阳性对照至C1、C2、D1、D2孔；加10μL待检血清到其他剩余的孔，各加两孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21士5）℃反应（45士4）min。用300μL/孔洗液洗板3次，最后一次拍干以去除残留洗液。将酶标结合物用酶稀释液10倍稀释后，加100μL至所有样品孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21土5）℃反应（30士3）min。同上洗板。加100μL底物液至所有样品孔。0密封微量反应板，室温（21士5）℃避光反应（15士2）min至颜色变化。1加1