SN_T 3449-2012昆虫介体中植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3449—2012昆虫介体中植原体检疫鉴定方法Detection and identification of candidatus phytoplasma in insect vector2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3449—2012前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：赵文军、陈岩、杨毅、杨旭光、牟海青、朱水芳。一 SN/T3449-2012昆虫介体中植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了昆虫介体中植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境及国内监测中同翅目和半翅目（具刺吸式口器）昆虫体内植原体的检疫和鉴定。2原理根据传播植原体的昆虫介体种类（参见附录A)及植原体的分子生物学特性进行鉴定。3仪器和试剂3.11仪器设备PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、移液器、电泳仪、凝胶成像系统。3.2主要试剂甘油、75%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸：三氯甲烷=6：1：3）、昆虫保存液（75%乙醇，1%甘油）、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TagDNA聚合酶、引物、TAE电泳缓冲液、DNA相对分子质量标准、SYBRGreenI等。4检测鉴定方法4.1昆虫的前处理昆虫饥饿处理12h，以防止昆虫肠道内食物DNA的污染。4.2昆虫体内植原体基因组DNA提取昆虫体内植原体基因组DNA的提取方法（见附录B)。4.3巢式PCR扩增及凝胶电泳检测用两对植原体扩增通用引物进行巢式PCR扩增并进行凝胶电泳检测（见附录C）。4.4虚拟RFLP指纹图谱检测见附录D。5结果判定5.1在4.3检测中，若用通用引物R16F2n/R16R2进行第二轮PCR后，PCR扩增产物经凝胶电泳检1 SN/T3449-2012测结果为阳性，而且片段大小为1.2kb左右，可初步判定该昆虫样品中携带植原体，但需通过4.4方案进一步检测。5.2在4.4检测中，克隆并测序植原体16SrDNA序列（引物R16F2n/R16R2扩增部分），经17种限制性内切酶进行虚拟酶切后获得虚拟RFLP指纹图谱，若与已知植原体的虚拟RFIP指纹图谱致，则可判定该样品携带该植原体。6样品保存与复核6.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字存以备复核了对检出植原体的同批昆虫强抗俄处理12h后漫泡于卡诺囤定液20min，然后转人昆虫保存液，冻于一20℃冰箱中保存。昆典SF20℃冰箱中所有样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理6.2结记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源种类时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员冷者电泳结果照片-测序结果要保存序列文件和序列比对文件。和审核人员签字。PCR凝胶电泳6.3复核由国家质量监督检验检疫总局指定位或大负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性TST和真实性，必要时进行复核试验。2 SN/T3449—2012附录A（资料性附录）植原体主要昆虫传播介体种类表A.1植原体主要昆虫传播介体种类地理分布寄主植物病害名称/植原体组编号昆虫介体名称叶蝉科（Cicadellidae）北美翠菊黄化病不同科的植物1Acinopterus angulatus Lawson北美核果类树木西方X病(16SriⅢ-A)2土豆土豆紫顶卷曲病(16SrⅢI-B)东南亚Alebroides nigroscutelltus茄属植物茄小叶病东南亚3Amruscadevastans三叶草三叶草变叶病（16SrIV）欧洲不同科的植物欧洲Aphrodesbicincta（双带脊冠叶蝉顽固病（16SrXI-A）4英国草莓三叶草草莓花变叶病（16SrI-C)澳大利亚三叶草叶皱缩卷曲病5Austroagallia torride茄科番茄目芽病（16SrV-A)澳大利亚6Bulrachomorphus punctatus芝麻芝麻变叶病中东地区7Circulifer haematoceps柠檬16SrV-16SrX以色列北美蔬菜甜菜叶蝉传播的绿变病北美8Circuliferlenellus(甜菜叶蝉)蔬菜番茄白芽病（16SrV-A）16$rV-16SrX柠檬以色列北美核果类树木东方×病（16SrⅡ-A）9Colladonusclitellarius（鞍形叶蝉）不同科的植物黎菊黄化病北美10Colladonus geminatus北美西方/x病(16SrⅢ-A)核果类树木北美核果类树木方X病（16SrⅢ-A）11