SN_T 4876.1-2017DNA条形码方法 第1部分：检疫性乳白蚁.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4876.1-—2017DNA条形码方法第1部分：检疫性乳白蚁DNA barcode-Part 1 :Quarantine Coptotermes spp.2018-03-01实施2017-07-21 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层套真伪 SN/T 4876.1—2017前言本部分为SN/T4876《DNA条形码方法》系列标准的第1部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本部分主要起草人：张卫东、权永兵、许彩芸、钱路、黄永辉、迟远丽、徐浪、廖力、徐森锋、余道坚、安榆林、王振华。 SN/T 4876.1--2017DNA条形码方法第1部分：检疫性乳白蚁1范围SN/T 4876 的本部分规定了我国检疫性乳白蚁的DNA条形码检测方法。本部分适用于我国进境植物检疫性乳白蚁DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1105　大家白蚁检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码DNA barcodes一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2凭证标本voucher specimensDNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。3.3CO I 基因线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c 氧化酶亚基 ⅡI（cytochrome c oxidase subunitⅡ），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。4乳白蚁基本信息中文名称乳白蚁学名:Coptotermes spp.分类地位：等翅目 Isoptera，鼻白蚁科 Rhinotermitidae，乳白蚁属Coptotermes Wasman。乳白蚁属是世界性的重要害虫种之一，目前全世界有效定名的乳白蚁近70种。主要危害房屋建筑中的木结构，也危害埋地塑料和绿化树木。乳白蚁近距离传播靠成虫飞行扩散，远距离传播主要借助于原木、板材、木方及木质包装等铺垫材料等扩散。1 SN/T 4876.1--20175方法原理根据乳白蚁的 COIⅡI序列特征，应用DNA条形码技术对乳白蚁进行鉴定。6仪器设备、用具及试剂6.1仪器设备与用具常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、酸度计、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、解剖镜、天平（感量1/10000）、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、一70℃冰箱、冰箱、微量移液器(0.5 μL,2 μL,10 μL,20 μL,100 μl,200 μL,1 000 μL)、PCR 反应管（0.2 mL,0.5 mL).6.2试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液(含 1% SDS、50 mmol/L Tris-HCI、25 mmol/L NaCl、25 mmol/L EDTA)、3 mmol/L KAc(pH7.2）、Tris 饱和酚、蛋白酶 K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、RNaseA、10× PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、r Taq DNA聚合酶、引物（见表 1）、DL2000 Marker、琼脂糖、溴化乙锭(EB)。表 1扩增引物目标基因引物序列扩增片段大小/bpTY-F5-GTGCATTGGATTTAAGCTCC-3COI763TY-R5-CTTGCTTTCAGTCATCTGATG-37DNA 条形码鉴定7.1朴样品的处理样品的处理见SN/T1105。尽可能选择新鲜标本，标本保存于无水乙醇中，每份标本单管保存，并做好唯一性标识。7.2核酸的制备取白蚁于双蒸水中漂洗，吸水纸吸干,解剖镜下剔除腹部,取胸部肌肉和足置于1.5 mLEppendorf管中,加人 40 μL 提取液(含 1% SDS,50 mmol/L Tris ·CI,25 mmol/L NaCI,25 mmol/L EDTA),放置于一70 ℃冰箱中,4 min后取出，用牙签捣碎,匀浆,加人等体积的 3 m