SN_T 4419.21-2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第21部分：牛奶.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4419.21—2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第21部分：牛奶Food allergen detection with LAMP methods for export-Part 21: Milk2016-03-09发布2016-10-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.21—2016前言SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：第1部分：开心果；第2部分：腰果；第3部分：胡桃；-第4部分：榛果；第5部分：杏仁；一第6部分：扁桃仁；第7部分：巴西坚果；第8部分：澳洲坚果；第9部分：栗子；一第10部分：大豆；第11部分：羽扇豆；第12部分：花生；第13部分：葵花籽；第14部分：芝麻；第15部分：大麦；第16部分：小麦；第17部分：荞麦；第18部分：芥末；第19部分：胡萝卜；第20部分：芹菜；-第21部分：牛奶；第22部分：虾。本部分为SN/T4419的第21部分，本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本部分主要起草人：曾静、张西萌、魏海燕、付溥博、陈颖、马丹、刘莉、赵晓娟。I SN/T 4419.21—2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第21部分：牛奶1＇范围SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原牛奶成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法。本部分适用于食品及其原料中过敏原牛奶成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检测限（LOD)为0.5%（质量分数）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1过敏原allergen又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。3.1.2牛奶milk一种白色的液体，由哺乳动物的乳腺分泌而来，是初生哺乳动物的主要食物来源，其中β-乳球蛋白是牛奶致敏的主要成分。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification)Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定。5方法提要样品经浓缩后，提取DNA，以DNA为模板，采用牛线粒体细胞色素b(cyt-b)基因特异性检测引物1 SN/T4419.21—2016进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原牛奶成分。6LAMP检测方法6.1原理根据牛线粒体细胞色素b基因序列设计特异性内引物、外引物各一对以及一条环引物，特异性识别靶序列上的7个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在线粒体特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreen·I发出微弱的荧光，但一且与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green 的荧光信号强度与dsDNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出LAMP反应体系存在的dsDNA数量。6.2仪器和设备6.2.1水浴锅或加热模板：65℃±1℃和80℃±1℃。6.2.2离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.3计时器。6.2.4移液枪：量程0.5μL～10μL、量程10μL～100μL、量程100μL～1000μL。6.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 CTAB 提取缓冲液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Naz EDTA,pH8.0)。6.3.3 CTAB沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmo