SN_T 5110-2019仙台病毒病检疫技术规范.pdf

ICS 65.020.30B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5110—2019仙台病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for Sendai virus infectious disease2019-09-03 发布2020-03-01实施学中国海雨出版社有限公司HG944440020783中华人民共和国海关总署发布香网理:www.customskb.co?刮开涂层激活密码 SN/T 5110—2019前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中华人民共和国广州海关。本标准主要起草人：蒋静、王艳、宋青、田纯见、黄忠荣、李健、王巧全、林颖、张强、熊炜。 SN/T 5110--2019仙台病毒病检疫技术规范1范围本标准规定了鼠仙台病毒病 RT-PCR 检测、Real-time RT-PCR 检测、免疫荧光试验、血凝抑制试验的操作方法。本标准适用于鼠仙台病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断鼠感染仙台病毒病临床上主要有两种不同的感染类型，可据此进行初步诊断：慢性型：呈地方性流行，病毒在鼠群中长期存在。多见于断乳后不久至42d的小鼠，通常为亚临床感染,病毒存活 14 d左右。急性型：常表现临床症状，在较短的时间内自愈或者转为地方流行。病鼠常表现为被毛粗乱，弓背，呼吸困难，眼角有分泌物，发育不良，消瘦等症状，怀孕母鼠妊娠期延长，新生乳鼠死亡率增加。大体解剖观察：主要病变出现于呼吸道和局部淋巴结，肺呈杨梅色，切开时有泡沫状血样液体流出。病变多见于尖叶、隔叶和心叶。组织病理学观察：分为三个阶段，急性阶段表现为炎症反应和靶细胞溶解；修复阶段表现为再生的靶细胞上皮增生；恢复阶段表现为实质瘫痕化收缩。4采样和样品前处理采集病鼠口鼻液、血液、粪便，以及肝、脾、肺、肾等组织器官。粪便或组织样品加等体积生理盐水（见附录A中A.1)研磨匀浆，3000g离心15 min，收集上清液待检。口鼻腔拭子、粪拭子用1mL生理盐水浸润后,取上清液待检。取鼠尾静脉血或动脉血，室温静置30 min，1000 g离心10 min,取上清液作为待检血清样品。5RNA抽提及cDNA模板制备5.1i试剂与设备5.1.1除特别说明外，实验用水应符合GB/T6682要求。5.1.2Trizol 试剂:4℃保存。5.1.3三氯甲烷、丙酮：常温保存。5.1.4异丙醇:使用前预冷至一20 ℃。1 SN/T 5110—20195.1.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。5.1.6逆转录酶及10倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为50 U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。5.1.71RNA 酶抑制剂：浓度为 40 U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。5.1.8随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50μmol/L，-20℃保存。5.1.9DEPC水：自配（见附录A中A.2)或购买商品化试剂。5.1.10高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达13000g以上。5.2RNA 抽提分别取100μL待检样品匀浆上清液，以及鼠仙台病毒阳性样品和阴性样品的上清液，加人1mLTrizol试剂（见5.1.2），用枪头充分吹打2030次；加人200μL三氯甲烷（见5.1.3），涡旋振荡30s混匀；13000g离心15min；取上层水相，加500μL异丙醇（见5.1.4），上下颠倒数次混匀，一20℃放置20min；13000g离心10min；弃上清液，沉淀用1mlDEPC水（见5.1.9）配制的75%乙醇（见5.1.5）清洗;8000g离心10min;弃上清液，沉淀室温干燥10min；加30μL DEPC水（见5.1.9）溶解RNA沉淀。RNA溶液应尽快用于逆转录合成cDNA模板。商品化RNA提取试剂盒同样适用于本标准的RNA抽提。5.3cDNA模板制备取18.5μLRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液（见5.1.6)2.5μL、dNTP1μL、随机引物（或待扩增引物对的下游引物)1μL、RNA酶抑制剂（见 5.1.7)1μL、逆转录酶（见 5.1.6)1μL。混匀后，置PCR仪上经42℃ 40 min、70℃ 10 min，即得cDNA模板。如果暂时不进行检测可将 cDNA模板保存至一20℃冰箱。6RT-PCR 检测及结果判定6.1试剂、材料与设备6.1.1Taq酶及10倍 Taq 酶浓缩缓冲液：