SN_T 3736-2013国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法Detection method for enterovirus 71(EV71 virus) by real timefluorescence RT-PCR at frontier ports2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国O发布国家质量监督检验检疫总局牛 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法SN/T 3736-2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷字数 10 千字开本880×12301/16印张 0.52014年4月第2014年4月第一次印刷一版印数 11 600*书号：155066·2-26935 SN/T 3736—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国四川出人境检验检疫局本标准主要起草人：刘胜牙、朱玉兰、田绿波、古莉冰、樊学军、谢聪贤、甄胜西、周连志、曾传萍孙体东、张妮奇、石莹。I SN/T境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了国境口岸手足口病EV71病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理,EV71 病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员携带EV71病毒的分子生物学检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（卫生部）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肠道病毒 71 型Enterovirus 71引起手足口病的主要病原体之一。属于小RNA病毒科（picornaviridae）中的肠道病毒属（enterovirus），A组肠道病毒。EV71病毒是单正链的无包膜 RNA病毒，小球形（直径 20 nm～30 nm）、20 面体对称结构。4缩略语下列缩略语适用于本文件RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)Ct值：循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阙值时所经历的循环数（Cycle threshold)RNA:核糖核酸(Ribonucleic acid)FAM:6-羧基荧光素，一种荧光报告基团（6-carboxy-fluorescein）TAMARA:6-羧基四甲基若丹明一种荧光淬灭基团（6-carboxytetramethylrhodamine)5生物安全要求5.1个人防护遵循GB19489。1 SN/T 3736—20135.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。5.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5.4疑似人感染EV71病毒的材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。6实验仪器设备6.1荧光定量 PCR仪。6.2超净工作台。6.3生物安全柜。6.4高压灭菌锅。6.5低温高速离心机：最大离心力20000g。6.6旋涡振荡器。6.7冰箱:4℃、一20℃和-70℃。6.8移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μl和 1 ml:6.9恒温水浴锅。6.10无菌注射器。7试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯7.1标本保存液：在新鲜配制的190mLEaglesMEM中加人.56℃热灭活30min的胎牛血清4ml、2 ml庆大霉素(5 000 μg/mL)、2 ml.两性霉紫 B(250.ig/ml)和2 ml.青链霉素（青霍素 G10 000 U/mL、链霉素10000 μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH值为7.2。7.2核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViral RNAKit提取病毒核酸!。7.3 实时荧光 RT-PCR试剂:TAKARA 公司 One stcp real time RT