SN 1682-2005蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1682—2005蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法Protocol of diagnosis for European foulbrood of honey bees2005-09-30 发布2006-05-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1682--2005前言本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)制定的《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2004版。本标准附录 A、附录 B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈世松、苏琳、朱开元、王建。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1682—2005蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法1范围本标准规定了蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法本标适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的检疫。2诊断原理蜜蜂欧洲幼虫腐臭病（European Foulbrood of Honey Bees）是由蜂房蜜蜂球菌（Melissococcuspluton)引起的蜜蜂幼虫的一种细菌性传染病。该病通常使（3～4）日龄的未封盖幼虫死亡。幼虫患病后常作不正常的运动而使位置错乱。同时，患病幼虫又可随时被工蜂清除，形成卵、幼虫、空房相间的“插花子脾”。临床上发现死亡幼虫呈黄白或暗褐色，并有酸臭气味，无粘性，即可疑为欧洲幼虫腐臭病。由于病原体为细菌，故可将临床上疑似蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的幼虫或死亡幼虫进行染色直接镜检可初步诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病，确诊需经分离培养后染色镜检。在普通光学显微镜下，蜂房蜜蜂球菌呈单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披针形球菌，大小为0.5m×10m。3设备、材料和试剂3.1设备3.1.1普通光学显微镜。3.1.2 CO2培养箱。3.2材料和试剂3.2.1无菌平皿。3.2.2载玻片。3.2.3 试管(10 mL)。3.2.42%石炭酸复红溶液。3.2.5无菌生理盐水。3.2.6牛肉膏琼脂平板。3.2.7牛肉膏琼脂斜面。4采样4.1采样比例+批蜂（幼蜂)数量小于或等于30只时全部采样。数量为30只～100只时，以30只采样量为基础，每增加10只，采样量增加1只。数量大于100只时，按每批总数的30%采样。4.2采样方法从蜂群中随机抽取子脾一张，按照5点式采样方法，分别从巢脾四角与中央各检查幼虫房30个，观察是否有患病幼虫存在。采样时尽量采取变色或死亡幼虫送实验室检查。5 方法与判定5.1直接检查法5.1.1挑取被检样品少许，加少量无菌生理盐水制成悬浮液。5.1.2将上述悬浮液1滴～2滴，放在干净的载玻片上涂匀，自然风干或置火焰上慢慢干燥。 SN/T 1682—20055.1.3用2%石炭酸复红液(参见附录 A)染色1.5 min～2 min,水洗，用滤纸吸干。5.1.4在普通光学显微镜(1000×～1500×）下进行检查。5.1.5结果判定：发现0.5m×10m大小成单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披针形球菌时，可初步判定为蜜蜂欧洲蜂幼虫腐臭病。5.2分离培养法5.2.1按无菌操作，取被检样品少许，加少量无菌生理盐水制成悬浮液。5.2.2用接种环取上述悬浮液，以划线法接种于牛肉膏琼脂（参见附录B)平板，置5%CO2的培养箱中,在35℃～37℃条件下,培养24.h～48 h。5.2.3挑取单个菌落，接种于牛肉膏琼脂斜面，置5%COz的培养箱中，在35℃～37℃条件下培养24 h~~48 h。5.2.4经过分离纯化的菌株，即可用接种环挑取菌落，放在于净的载波片上，加1滴～2滴生理盐水涂匀后风干或干燥。用5.1.3的染色方法染色后，在普通光学显微镜下检查。5.2.5结果判定：发现0.5m×10m大小成单个或成串或头尾相接成对或成短链状或成簇状排列的短披针形球菌时，可判定为蜜蜂欧洲蜂幼虫腐臭病。2 SN/T 1682—2005附录A（资料性附录）2%石炭酸复红液的制备碱性复红4g，溶于95%乙醇100mL中，再取此液10mL与5%石炭酸溶液90mL混匀即成。附录B(资料性附录)牛肉膏琼脂培养基的制备牛肉膏1g，蛋白陈1g，氯化钠0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL,将上述各种成分混合，加溶解，调节pH值至7.0,在0.068MPa压力下，高温灭菌消毒15min。 00289 1/NS中华人民共和国出人境检验检疫行业标准蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法SN/T 1682—2005中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16　印张0.5　字数5千字2006年1月第一版　2006年1月第一次印刷印数