NY 678-2003猪伪狂犬病免疫酶试验方法.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 678—2003猪伪狂犬病免疫酶试验方法Enzyme immunoassay for porcine pseudorabies2003-07-30 发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 678—2003前言本标准的附录 A 是规范性附录。本标由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标推起草单位：农业部兽医诊断中心。本标主要起草人：王宏伟、吴清民、童光志、田克恭、陈西钊、苏敬良、王传彬。 NY/T 678—2003猪伪狂犬病免疫酶试验方法1范围本标准规定了猪伪狂犬病 E糖蛋白(gE,即 gp I）酶联免疫吸附试验和免疫酶组织化学试验方法。本标准适用于检测猪血清中的猪伪狂犬病病毒 gE特异性抗体和组织中的猪伪狂犬病病毒抗原。2 E 糖蛋白酶联免疫吸附试验(gE-ELISA)2.1材料准备2. 1. 1 试剂a)1ELISA抗原包被板；b)）标准阳性血清:伪狂犬病病毒 gE单克隆抗体;c)标准阴性血清:无伪狂犬病病毒 gE抗体的猪血清;d)酶结合物:辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗伪狂犬病病毒gE单克隆抗体;e)磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第 A.1章;0)洗涤液：配制见第A.2章；样品稀释液：配制见第A.3章；g)h)底物溶液：配制见第A.5章；i)终止液：配制见第A.6章。器材2. 1. 2a)酶联检测仪;b)微量加样器，容量50μL～200μL；c)337℃恒温培养箱。2.1.3样品采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作2倍稀释。2.2操作方法2.2.1取出包被板，并将样品位置准确记录在记录单上。2.2.2向 A,、Az、As孔中分别加人100 uL未经稀释的阴性对照血清，A4、As、A。孔中分别加人100 μL未经稀释的阳性对照血清，其他各孔加人100 μL稀释好的待检样品。2.2.3 置室温 1 h。2.2.4弃去孔内液体，再在纱布或吸水纸上拍干。2.2.5 用洗涤液将反应板洗涤(3～5)次,每次洗涤后均弃去孔内液体。最后一次洗涤后，除净孔内液体,拍干。2.2.6每孔加人100μL酶结合物溶液，室温下作用20 min。2.2.71重复 2.2. 4和 2. 2. 5。2.2.8，各孔加人100μL底物液。2.2.9室温放置 15 min。2.2.10各孔加人50μL终止液，立即用酶标仪于650nm测定各孔吸光度(OD)值。2. 3 结果判定2.3.1只有在阴性对照OD值的均值减去阳性对照OD值的均值大于等于0.3时，试验成立。1 NY/T 678—20032.3.2待检样品是否含有针对gE抗原的抗体取决于每个样品的S/N值，S/N等于样品OD值除以阴性对照 OD均值。如果样品的 S/N值小于等于0.6,表明血清中含伪狂犬病病毒gE抗体。如果S/N值大于0.6、小于等于0.7,应重新检测样品。如仍得到相同的结果，三周后应重新采样检测。如果S/N值大于0.7,表明血清中无gE抗体。3免疫酶组织化学法3.1材料准备3. 1. 1 试剂a）石磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章;b）标准阳性血清：伪狂犬病病毒实验感染猪制备的血清；c)标准阴性血清：无伪狂犬病病毒感染、未经免疫的猪血清；d)酶结合物：HRP标记的SPA；e）底物溶液：配制见第A.7章；f)过氧化氢甲醇溶液：配制见第A.8章；g）i盐酸酒精溶液：配制见第A.9章；h)胰蛋白酶溶液：配制见第A.10章。3.1.2器材a）普通光学显微镜；b）↑微量加样器，容量50uL～200μL;c)石蜡切片机或冷冻切片机；d)载玻片及盖玻片；e）37℃恒温培养箱或水浴箱。3.1.3样品对疑似伪狂犬病的病死猪或扑杀猪，立即采集肺、扁桃体和脑等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存,送检。3.2操作方法3.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10 min～15min;新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱蜡至PBS（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱片）。3.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37℃作用20min。3.2.3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2 min，以便充分暴露抗原。3.2.4漂洗:PBS漂洗三次，每次5 min。3.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用30min。3.2.6加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清,37℃湿盒中作用1h或37℃湿盒中作用30min后4℃