SN_T 2667-2010转基因微生物定性检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2667—2010转基因微生物定性检测方法Qualitative detection for genetically imodified microorganisms2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T2667-2010言前本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：梁新苗、陈红运、赵文军、陈双雅、朱水芳、陈洪俊。 SN/T 2667—2010转基因微生物定性检测方法1范围本标准规定了转基因微生物的定性检测方法本标准适用于携带生化显色标记基因、发光酶基因、氨下青霉素和卡那霉素抗性基因的转基因微生物的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文3. 1. 1 genetically /modified micrdorganis mS ;GMM转基因微生物通过基因操作技术对遗传物质(DA)进行重组、修饰，从市改变塞因组构成的微生物。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。GFP(green fluorescent protekn）：绿色荧光蛋白gusA(β-glucuronidase)：β葡糖香酸酶基因LacZ:β-半乳糖苷酶基因Luc:真核生物荧光素酶基因LuxAB:细菌荧光素酶基因X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-Dgalactopyranoside）：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷X-GlcA（5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronide）：5-溴-4-氯-3-吲哚-β葡糖苷酸xylE(catechol 2,3-dioxygenase)：邻苯二酚2,3-双加氧酶基因原理4.1选择性培养选择性培养作为一种简单、灵敏的方法可对转基因微生物进行检测。在含有某种抑制自然存在微生物种群生长的化合物（如：抗生素、重金属等）的培养基止，选择性的培养转基因微生物。根据GMM1 SN/T2667—2010上带有的特殊抗生素特性，如卡那霉素（kanamycin，Kan）、壮观霉素（spectinomycin，Spc）、潮霉素B(hygromycinB)等抗生素基因，或是抗重金属等特点采用相应培养基进行培养筛选，从而对相应的转基因微生物进行检测。4.2报告基因检测4.2.1概述通常所用的报告基因，例如Luc、Lux、LacZ、xylE和gusA在选择性培养基上是高度灵敏和高度特异的。其中LacZ基因是应用最为广泛的一类报告基因。而带有生物发光基因的GMM可以应用多种手段如发光记录仪、X光胶片以及CCD成像等检测。利用转基因微生物带有的报告基因在培养基上所表现的不同表型对其进行检测。这些表型可以是某种代谢特性，或是不同的生物发光能力。4.2.2生化显色标记基因β半乳糖苷酶基因(LacZ)是由Drahos等于1986年第一个采用的非抗生素标记基因。带有该基因的微生物在含有底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β半乳糖苷的平板上或溶液中使菌落变成蓝绿色。4.2.3发光酶基因发光酶基因（LuxAB,Luc)已分别从发光海洋弧菌和萤火虫中克隆得到，前者编码的发光酶能作用于长链脂肪醛而产生发光现象；后者编码的酶在ATP存在下催化D-荧光素的氧化反应生成氧化荧光素和黄-绿色光。4.2.4绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(GFP)是一类存在于包括水母、水螂和珊瑚等腔肠动物体内的编码生物发光蛋白的基因。GFP在受到紫外或蓝光激发时，发出绿色荧光。4.3PCR检测大多数GMM均带有特殊的DNA序列，如特定的抗性基因和报告基因，因此可用PCR扩增方法进行检测。对转基因微生物进行PCR检测，是针对转基因微生物的外源基因序列区域设计一对特异性引物，通过PCR扩增即可判定样品中是否含有特定的外源基因，从而检测GMM。5仪器和试剂5.1仪器5.1.1(CCD照相机。5.1.2 PCR仪。5.1.3走超净工作台。5.1.4消毒灭菌锅。5.1.5培养皿。5.1.6恒温培养箱。5.1.7制冰机。5.1.8核酸蛋白分析仪。5.1.97高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。5.1.10·凝胶成像分析系统。2 SN/T2667—20105.1