SN_T 4397-2015出口食品中牦牛源性成分的检测方法 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4397—2015出口食品中耗牛源性成分的检测方法实时荧光PCR法Detection of yak(Bos grunniens )in food products for export-Real-time PCR method2015-12-04发布2016-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4397—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈颖、王娉、韩建勋、杨捷琳、黄文胜、吴亚君。I SN/T4397—2015出口食品中耗牛源性成分的检测方法实时荧光PCR法1范围本标准规定了出口食品中耗牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉及肉制品中耗牛源性（九龙耗牛、麦洼耗牛、甘南耗牛、巴州耗牛、斯布耗牛、嘉犁耗牛、中甸耗牛、天祝白耗牛）成分的定性检测。本标准所规定方法的最低检出限（LOD)为0.625%（质量分数）。22规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1耗牛 Bos grunniens一种生活在高寒地区的牛属牛亚科动物。3.2耗牛源性成分yakderivedmaterial耗牛特异性的DNA片段。3.3实时荧光PCR real-time PCR在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。3.4Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。4方法提要称取混匀的肉及肉制品，提取DNA，以DNA为模板，采用耗牛细胞色素b基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在耗牛源性成分。1 SN/T4397-20155试剂和材料5.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.2耗牛源性成分扩增引物和探针、内参照（真核生物18sRNA.基因)引物和探针详见表1。表1试验用引物和探针名称序列（5→3）目的基因内参照5端引物TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA内参照3端引物AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT真核生物18sRNA基因内参照探针FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMAR耗牛5端引物GACTAATATTCGAAAATCC耗牛3端引物CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC耗牛细胞色素b基因耗牛探针FAM-CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT-TAMAR5.3CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20 mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。5.4TE缓冲液(Tris-HCI、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HC(pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。5.5蛋白酶K:20mg/μL。5.6RNA 酶溶液:5μg/μL。5.7Tris 饱和酚。5.8三氯甲烷。5.9异戊醇。5.10异丙醇。5.1170%乙醇。5.12Tag DNA聚合酶。5.13dNTP混合液。5.1410XPCR缓冲液:200 mmol/LTris-HCl(pH8.4),200 mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。6仪器设备6.1实时荧光PCR仪。6.2离心机：最大离心力≥16000g。6.3微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4冰箱2℃～8℃,一20℃。6.5高压灭菌器。6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7pH计。6.8天平：感量0.01g。6.9涡旋仪。2 SN/T 4397-20157检测步骤7.1DNA提取7.1.1从原始样品中取出部分有代表性的样品，用绞碎机绞碎，充分混匀。称取0.1g经混匀的肉及肉制品于2mL离心管中，加人1.5mL的ddH2O洗涤两次，加人600μLCTAB缓冲液和40μL蛋白酶K，65℃1h，期间每隔10min振荡混