SN_T 3170-2012葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3170—2012葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xylella fastidiosa2012-05-07 发布2012-11-16 实施中华人民共和国B：发布数码防伤国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3170--2012言前本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邓丛良、张凯、高文娜、吕玉峰、梁新苗、刘鹏。I SN/T 3170—2012葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了进境植物检疫中葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物苗木、繁殖材料和植物产品的葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文伴，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1860植物病毒免疫电镜检测方法3原理3.1葡萄皮尔斯病菌的分类地位葡萄皮尔斯病菌学名Xylella fastiaiosa-Wells-etat,1987,该菌属原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门(Phylum Gracilicutes），木质部小菌属（Xylella)3.2 检疫鉴定依据以病菌在寄主上的症状特点、瘀菌形态学特征吸其培养特性病菌种的特征以及基因组序列作为葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定依据，必妻时辅助进行致病性测定（参见附录A)4仪器设备、试剂及用具4.1仪器、设备、用具超净工作台、生物培养箱、电子天平、酶标仪、PCR仪、凝胶成像仪、水浴锅、高速冷冻离心机、高压灭菌锅、透射式电子显微镜、冰箱、液氮罐、解剖刀片、白磁盘保湿盒、研钵、微量移液器（可调式范围：2.5 μL～1000 μL)、吸头(10 μL、100 μL、1 000 μL)、离心管(1.5 mL)、PCR 管、酶联板。4.2试剂和培养基检验所需的药品均为分析纯。检验中用到的试剂琥珀酸-柠檬酸-磷酸盐缓冲液，其配制方法见附录B。检验中用到的PD2培养基、CS20培养基、PW培养基、SPW培养基，其配制方法见附录B。5葡萄皮尔斯病菌的鉴定5.1双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录C），若检测结果为阳性，需进行病原 SN/T的分离培养或者 PCR方法检测。5.2葡萄皮尔斯病菌的分离、培养和鉴定5.2.1葡萄皮尔斯病菌的分离培养植物样品叶片中葡萄皮尔斯病菌的分离培养：a）叶片表面用3.0%次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水漂洗4次；b）用无菌刀片切下叶片的中脉和叶柄，切出一个2 mm～3 mm 的截面，将汁液划线到 PD2或CS20培养基上（柑橘叶片将汁液划线到PW或者SPW培养基上）；c）划线后的平板放在塑料袋中于28℃生物培养箱中培养。植物样品根或者茎中葡萄皮尔斯病菌的分离培养：a）取根或茎用5.0%次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水漂洗4次；b）用解剖刀将根或茎切割长为 4 mm～12mm,直径2mm～3mm 的小段。然后用琥珀酸-柠檬酸-磷酸盐缓冲液进行真空渗透；c）1真空渗透提取物（每个样品3mL～4 mL)在4500r/min下离心15min；离心后的沉淀用0.8 mL的琥珀酸-柠檬酸-磷酸盐缓冲液悬浮，取一滴（5μI.)滴到 PD2或d)）7CS20培养基上（柑橘用PW或者SPW培养基上）；e）平板在 28℃中培养，将平板放在塑料袋中防止培养基干燥。5.2.2葡萄皮尔斯病菌的菌落特征葡萄皮尔斯病菌在 28℃培养 10 d之后可以看到分离的菌落。菌落直径一般为 0.5 mm～2.0mm，圆形，完整的边缘和表面凸起；有时候形成的菌落具有波浪形的边缘，表面扁平。5.3葡萄皮尔斯病菌的电镜观察按SN/T1860的规定进行电镜观察。5. 4葡萄皮尔斯病菌 PCR 检测用 PCR对病原菌进行检测的方法见附录 D。6结果判定酶联测定为阳性后，经PCR检测待测样品的序列与GenBank中已知的葡萄皮尔斯病菌同源性为100%或者分离培养性状结合电镜观察为阳性即可判断为葡萄皮尔斯病菌。7样品保存与复核7.1　样品保存葡萄皮尔斯病菌为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在1周内接受复核。病菌要有活体样品存在，其他实验样品应妥善保存于4℃冰箱中，以备复核。7.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和2 一 SN/T 3170--2012实验人员的签字。酶联测