NYT 1730-2009食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法.pdf

ICS 65.020B 61NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1730—2009ISSR法食用菌菌种真实性鉴定Verification of genuineness for edible mushroom spawn--IsSR2009-04-23发布2009-05-20实施中华人民共和国农业部o发布 NY/T1730—2009前言本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：黄晨阳、李辉平、张金霞、陈强- NY/T1730—2009食用菌菌种真实性鉴定ISSR法1范围本标准规定了ISSR技术鉴定食用菌菌种真实性的方法。本标准适用于对糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）、香菇（Lentinulaedodes）、黑木耳（Auiculariaauricula）、白灵菇（Pleurotusnebrodensis）、杏鲍菇（Pleurotuseryngii）、白黄侧耳（Pleurotuscornucopiae）、肺形侧耳（Pleurotuspulmonarius）、佛州侧耳（Pleurotusfloridanus）、灰树花（Grifolafrondosa）、金针菇（Flammulina velutipes）、滑菇（Pholiota nameko）、茶树菇（Agrocybe cylindracea）、鸡腿菇（Coprinuscomatus）等食用菌菌种真实性的鉴定，包括母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。NY/T1097—2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法3原理ISSR方法是以锚定微卫星DNA为引物，即在微卫星DNA序列的3端或5端加上2个～4个随机核苷酸，对基因组DNA进行PCR扩增，得到与锚定引物互补的重复序列的区间DNA片段。不同物种基因组DNA中的这种反相重复的微卫星序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，从而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对PCR产物的检测和比较，即可识别样本基因组DNA的多态片段，从而鉴定样本的真伪，4试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。4.170%乙醇溶液：见附录A.1。4.21mol/LTris-HCl(pH8.0)：见附录A.2。4.30.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液：见附录A.3。4.4CTAB提取缓冲液：见附录A.4。4.5TE缓冲液：见附录A.5。4.650XTAE缓冲液：见附录A.6。4.7加样缓冲液：见附录A.7。4.8核酸染料，按使用说明操作。4.9苯酚一三氯甲烷一异戊醇溶液=25十24十1。4. 100三氯甲烷一异戊醇溶液一24十1。4.11无水乙醇4. 12四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液。4. 133TagDNA聚合酶。4.1410×PCR反应缓冲液。1 NY/T 1730——20094. 15DNA分子量标记。4.16引物：参见附录B。5仪器5.1紫外分光光度计。5.2高速冷冻离心机（转速不小于10000r/min)。5.3高压灭菌锅。5.4PCR扩增仪。5.5电泳仪。5.6电泳槽。5.7紫外透射仪。5.8凝胶成像系统或照相系统。6操作步骤6.1DNA模板的制备6.1.1菌丝体培养将供检菌种与对照菌种在相同条件下培养，培养量可供做3个平行试验。采用PDA培养基配方：马铃薯200g（用浸出汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然。培养条件：直径75mm或90mm培养皿，24℃士1℃避光、隔膜培养。糙皮侧耳、白黄侧耳、肺形侧耳、佛州侧耳和茶树菇培养7d～9d；金针菇、鸡腿菇、白灵菇、杏鲍菇培养9d～12d;灰树花、黑木耳、香菇和双孢蘑菇培养12d～15d。6.1.2DNA模板的制备按照附录C制备供检菌种、对照菌种和阴性提取对照的DNA模板。6.2ISSR扩增6.2.1引物从附录B中筛选10个引物。如果必要可以筛选新的引物。6.2.2反应体系PCR反应的总体积为20μL，含有1XPCR反应缓冲液，0.2mmol/LdNTP，1UTaqDNA聚合酶4.0.4μmol/L引物，20ng～50ng模板DNA，加灭菌双蒸水至20μL。按上述比例将反应液依次加人0.2m