NY 683-2003犬传染性肝炎诊断技术.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 683--2003犬传染性肝炎诊断技术Diagnostic techniques for infectious canine hepatitis2003-07-30 发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 6832003前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬、杨秀勇。 NY/T 683—2003犬传染性肝炎诊断技术范围本标准规定了犬传染性肝炎(ICH)的临床诊断、犬传染性肝炎病毒(ICHV)的分离与鉴定、酶联免疫吸附试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术。本标准适用于犬传染性肝炎的诊断。2临床诊断要点2.1临床症状最急性病例,患犬在呕吐、腹痛和腹泻等症状出现后数小时内死亡。急性型病例,患犬体温呈马鞍型升高,精神抑郁,食欲废绝,渴欲增加,呕吐，腹泻,粪中带血。亚急性病例，特征性症状是患犬角膜-过性混浊，即“蓝眼”病,有的出现溃疡。慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期，患犬多不死亡，可以自愈。2.2. 病理变化病犬主要表现全身性败血症变化。在实质器官、浆膜、粘膜上可见大小、数量不等的出血斑点。肝肿大，呈斑驳状,表面有纤维素附着。胆囊壁水肿增厚,灰白色,半透明,胆囊浆膜被覆纤维素性渗出物，胆囊的变化具有一定的诊断意义。3 病毒分离与鉴定3.1材料准备3. 1. 1 试剂改良最低要素营养液(DMEM)培养基,配方见第 A.1 章。犬肾传代细胞(MDCK细胞)。标准阳性血清：ICHV单克隆抗体，中和抗体效价1：1024。3. 1. 1. 4本标准阴性血清：无ICHV感染的犬血清3. 1. 1. 5新生牛血清,青霉素,链霉素。3. 1.2器材a)细胞培养瓶;b)吸管;c)二氧化碳培养箱；d）37℃恒温水浴箱；e)普冰箱及低温冰箱；f)离心机及离心管;g）研磨器械;h）普通光学显徽镜;i）微量加样器,容量 5μL～50 μL,50 μL～200 μL;j）0.45 μm微孔滤膜。3.1.3样品ICHV存在于病犬扁桃体、肝脏、脾脏等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清 DMEM 制成20%组织悬液，3000r/min离心30min。取上清10000r/min离心20min，取上清用于ICHV分离。 NY/T 683-20033.2操作方法3.2.1细胞培养用含8%新生牛血清的 DMEM 培养基,在 37℃培养 MDCK细胞。每3d～4 d传代一次，细胞长成单层时，用于 ICHV分离。3.2.2 病料接种将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCK细胞,37℃吸附1h,加人无血清 DMEM继续培养 3d～5 d,观察结果。3.2.3结果观察ICHV 感染 MDCK 细胞3d～5d表现为细胞增大变圆、变亮、折光性增强、聚集成葡萄串状。若第-次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后育传三代。如仍无细胞病变，则判为 ICHV 检测阴性。3.2.4　ICHV 的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物,用 1%人“O型红细胞进行血凝试验，血凝试验阳性者,再用 ICHV单克隆抗体进行血凝抑制试验，鉴定毒株。4酶联免疫吸附试验4.1材料准备4.1.1试剂ELISA抗原包被板。标准阳性血清：用ICHV抗原免疫犬获得的血清。4. 1. 1. 2#标准阴性血清:无 ICHV 感染的犬血清。#酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗犬 IgG。4. 1. 1. 4磷酸盐缓冲液（PBS)：配制见第A.2章。4. 1. 1.5不洗涤液：配制见第A.3章。4. 1. 1.64. 1. 1.7样品稀释液：配制见第A.4章。4. 1.1.8底物溶液：配制见第A.6章。终止液：配制见第A.7章。4.1.2器材a）酶联检测仪；b）微量加样器，容量50μL～200μL；c）37℃恒温培养箱。4.1.3样品采集被检犬血液,分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作1：160倍稀释。4.2操作方法4.2.1试验设阴性对照、阳性对照各两孔和空白对照一孔。4.2.2在微孔反应板孔中加入1：160稀释的待检血清、阴性对照血清、阳性对照面清各100 μL,充分混匀后，置37℃作用20 min。4.2.3弃去各孔中液体、甩干。每孔加满洗涤液漂洗三次，每次 2 min，甩干。4.2.4每孔加人酶结合物100μL，置37℃作用20min。4.2.5重复 4.2.3。4.2.6每孔人底物液100μL，置37℃避光显色10min。4.2.7每孔加人终止液50μL，置酶联检测仪于450nm波长测定各孔吸光度(OD)