SNT 2014-2007番茄黑环病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2014—2007番茄黑环病毒检疫鉴定方法 Identification of tomato black ring virus2007-12-24发布2008-07-01实施华人中民共和国发布国家质量技术监督检验检疫总局尿理线 治高估数码防伪“ SN/T言本标准的附录 A、附录 D为规范性附录,附录 B、附录 C为资料性附录。本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：夏惠娟、杨翠云、刘勇、郭京泽、刘鹏、廖芳、罗加凤、于翠。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2014—2007番茄黑环病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了番茄黑环病毒检疫鉴定的方法。本标准适用于所有进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1双抗体夹心酶联免疫吸附测定在固相支持物上（酶联板)包被病毒特异性抗体，加入待测样品后，再用酶标记的病毒抗体进行免疫识别,最后通过酶促化学反应检测病毒是否存在的一种血清学检测方法。2.2RT-PCR利用反转录酶将病毒 RNA反转录为 cDNA,并以耐热 DNA 聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温（DNA分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸)交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。3原理番茄黑环病毒学名［Tomato black ring virus(缩写：TBRV)］、分类地位：豇豆花叶病毒科（Comovi-ridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。该病毒主要通过介体传播（线虫 Longidorus attenuatus 和 L.elongatus）、机械传播、种子（繁缕和大豆等)传播，也可通过无性繁殖材料的运输等进行长距离传播。该病毒粒体为等轴多面体病毒,直径约为30 nm。该病毒基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.358kb;RNA-2长4.618kb(英国血清型)和4.662kb（德国血清型）。该病毒的血清学、生物学、分子生物学和粒体形态等特性是鉴定该病毒的依据。4仪器设备和设施、用具和试剂4.1仪器设备酶标仪、电子天平（1/10000g）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、透射电子显微镜、微量榨汁机、水浴锅、低速离心机（转速为3000r/min～5000r/min）、生物培养箱（具有光照条件，温度可控制范围为0℃～50℃）、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱。4.2设施隔离温室（10℃～30℃）4.3用具可调式微量移液器(2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的移液器吸头、酶联板、Eppendorf管、研钵、pH计或各范围的pH试纸条、量筒、封口膜、吸水纸、白瓷盘及镊子等。1 SN/T 2014—20074.4试剂酶联反应检测试剂（见附录A）、摩擦接种检测试剂（参见附录B）、免疫电镜检测试剂（参见附录C)、RT-PCR 检测试剂（见附录 D)。5病毒检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（见附录A）、摩擦接种检测方法（参见附录B)、免疫电镜检测方法(参见附录 C)、RT-PCR检测方法(见附录D)进行检测。6结果判定6.1样品酶联检测结果为阴性,RT-PCR 检测也为阴性，判定为不携带番茄黑环病毒。6.2样品酶联检测为阳性，出现任何一种下列情况,均可判定为携带番茄黑环病毒：-RT-PCR 检测为阳性摩擦接种检测，鉴别寄主反应与附录B描述相符合；-电镜下观察到符合附C所描述的病毒粒子形态。6.3样品酶联检测为阳性，出现下面任一情况,判定为不携带番茄黑环病毒：-RT-PCR 检测为阴性;摩擦接种检测，鉴别寄主反应与附录B描述不符合；-样品在电镜下未观察到符合附录C·所描述的病毒粒子形态。7样品保存和复核7.1样品保存经检验确定携带番茄黑环病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下，其他情况的取实验样品保存在一20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好，做好登记和标记C工作。7.2结果记录与资料保存记录包括：样品来源、种类取样人员、实验的时间、地点方法和结果、检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，免疫电镜应有病毒粒子的图片，RT-PCR检测应有电泳结果照片。7.3结果复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位和及员进行复核，考察实验记录、数据或图片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验 SN/T 2014—2007附录A（规范性附录