NY_T 3293-2018黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程.pdf

ICS 07.100.01B 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3293-2018黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程Technical regulations for activity identification of biocontrol strains againstAspergillus flavus2018-12-01实施2018-07-27 发布中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3293—2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、国家农业检测基准实验室（生物毒素）、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：李培武、张奇、岳晓凤、余秋玉、喻理、白艺珍。I NY/T 3293—2018黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程1范围本标准规定了黄曲霉生防真菌（霉菌及酵母）、细菌和放线菌活性的鉴定方法。本标准适用于真菌类（霉菌及酵母）、细菌类和放线菌类生防菌对黄曲霉生防活性的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数GB 4789.155食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB 5009. 22食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T2310花生黄曲霉侵染抗性鉴定方法3原理将生防菌株与产毒黄曲霉菌株共培养，通过测定生防菌对黄曲霉菌丝生长、分生孢子萌发、侵染及产毒的抑制率，鉴定黄曲霉生防菌的活性。4培养基、试剂及材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的相关要求4.1PDA培养基：参见附录A中的A.1。4.2沙氏液体培养基：参见A.2。4.3LB液体培养基：参见A.3。4.4高氏1号培养基：参见A.4。4.5吐温水溶液：参见A.5。4.60.2%氯化汞溶液：参见A.6。4.70.1%次氯酸钠：参见A.7。4.8无菌水：121℃灭菌20min，备用一4.9黄曲霉菌株：Aspergillus flauus strain 3.4408,能产生黄曲霉毒素Bi、黄曲霉毒素Bz、黄曲霉毒素 GI和黄曲霉毒素 G2。4.10大肠杆菌菌株：EscherichiacoliTOP10F。4.11待测生防菌株。5仪器设备5.1生物安全柜：二级。5.2高压灭菌锅。1 NY/T 3293—20185.3恒温恒湿培养箱。5.4恒温摇床。5.5烘箱。5.6高速粉碎机。5.7生物显微镜：物镜4倍～100倍。5.8　电子天平：感量±0.01g,感量±0.0001g。5.9 pH计。5.10无菌锥形瓶：容量50mL，容量500mL。5.11烧杯：容量100mL。5.12无菌培养皿：内径90mm。5.13微量移液器及枪头：10μL，200μL，1mL。5.14无菌打孔器：内径6mm。5.15无菌滤纸片：直径6mm，直径9cm。5.16血球计数板。5.17直尺：量程20cm。6菌种准备6.1黄曲霉菌饼准备生物安全柜中接种黄曲霉菌株于平板PDA培养基上，30℃、相对湿度90%、黑暗培养4d，用无菌打孔器在菌落边缘制取直径6mm的菌饼，备用。6.2黄曲霉分生孢子悬浮液配制将6.1中接种黄曲霉的平板，在30℃、相对湿度90%、黑暗中培养7d，用5mL吐温水溶液洗脱分生孢子，用血球计数板在生物显微镜下计数，调整孢子浓度为1×108个/mL和1×106个/mL，备用。6.3大肠杆菌菌悬液配制生物安全柜中接种大肠杆菌于LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养24h后，10倍系列梯度稀释，按GB4789.3中规定的大肠菌群平板计数法计算菌体浓度，调整菌体浓度为1X101°CFU/mL和1×108CFU/mL，备用。6.4生防菌株培养及菌悬液配制6.4.1生防菌株培养按GB4789.28的规定选择适宜的培养基和培养条件进行真菌类（霉菌和酵母菌）、细菌类、放线菌类生防菌株培养。6.4.2生防菌悬液配制真菌类生防菌霉菌类生防菌产孢培养后，进行分生孢子洗脱，洗脱方法同6.2。按GB4789.15的规定对霉菌分生孢子及6.4.1中培养的酵母进行计数，配制霉菌分生孢子及酵母菌悬浮液，浓度为1×1010CFU/mL和1×10°CFU/mL，备用。细菌类生防菌配制细菌类生防菌菌悬液，浓度为1X1010CFU/mL