SN 1162-2002传染性胰脏坏死病毒（IPNV）酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1162-2002传染性胰脏坏死病毒（IPNV）酶链免疫吸附试验（ELISA）诊断方法Test method of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for infectious pancreatic necrosis yirus(IPNV)2003-05-01实施02-11~25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准传染性胰脏坏死病毒(IPNV)酶链免疫吸附试验(ELISA)诊断方法SN/T 1162--2002*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：10004568517548电话国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*字数10千字开本 880×1230 1/16印张1/22003年3月第一版2003年3月第一次印刷印数12 000*网址 侵权必究版权专有举报电话：（010SN/T 1162—2002前言本标准是在参考国际上通用的检测规程和总结我国在这一领域的实践经验的基础上制定的，作为对1996年发布的GB/T 15805.1--1995《淡水鱼类检疫方法第一部分》的一个补充。鉴于国前ELISA快速检测技术已经成熟，具有灵敏、推确、快速的优点，制定此标准有极强的实用性，对已有的国家标准能起到一个补充作用。本标准的附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：江育林、刘、高隆英、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1162--2002传染性胰脏坏死病毒(IPNV)酶链免疫吸附试验（ELISA)诊断方法1范围本标准规定了用酶联免疫吸附试验检测 IPN 病毒的方法。本标准适用于IPN 病毒的分离及病毒抗原的鉴定，及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)GB18088--2000　出人境动物检疫采样3试剂和材料3.1 水应符合GB/T6682一1992中二级水的规格。3. 2 IPN-sp 病毒3.3阴性对照正常细胞组织悬液（自备）。3. 4 IPN-sp 病毒标准抗血清3.5酶标羊抗兔IgG4器材和设备4.196孔细胞培养板。4. 2酶标板。4.3酶标测定仪。4.4微量移液器等。4.5 倒置显微镜。4.6恒温培养箱。4.7普通冰箱和低温冰箱。4.8 组织研磨器。4.9离心机和离心管。5 IPN 病毒的分离5.1 采样对有临床症状的鱼，体长小于等于4cm的鱼苗取整条，体长4cm～6 cm的鱼苗取内脏（包括肾）；1 SN/T 1162—2002体长大于 6 cm的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾成熟雌鱼还需取卵巢液:按 GB 18088-2000采样。5.2样品处理应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品勾浆。再用培养液（见附录A.1)按1：10的最终稀释度悬浮。在匀浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素的培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r/min离心15min，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5. 3 病毒分离对上述1：10的组织勾浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1000三种稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24h的RTG-2，CHSE或者PG新鲜细胞单层中，每2cm的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～20℃吸附1h后，加人细胞培养液。置于18C土2C培养。阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍～100倍倒置显微镜检查。如果接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE变出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织勾浆上清稀释液的细胞单层培养物。7000r/min，4℃离心15min，收集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天40倍到100倍倒置显微镜检查。如果在阳性对照组也未出现CPE，则必须采用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。6 IPN 病毒的鉴定6.1