SN 1674-2005锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1674—2005锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程Protocol of viral isolation and polymerase chain reactionfor koi herpesvirus2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1674—2005前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、高隆英、史秀杰、何俊强、杨锦舜、江育林。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T 1674—2005锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应试验操作规程1 范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒(KHV)分离和聚合酶链反应(PCR)检测方法。本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987）GB/T18088—2000出人境动物检疫采样3试剂和材料3.1水：符合GB/T6682—1992中一级水的规格。3.2.KHV 病毒参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。3.3锦鲤鳍条细胞(KF）：用 Eagles培养液（见第 A.9章)培养于25℃。3.4Tag 酶：一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5dNTP:含 dCTP.dGTP,dATP,dTTP 各 10 mmoL/L.3.6引物:浓度为40 μmoL/L。其序列如下：KHV9/5F:5-GAC GAC GCC GGA GAC CTT GTG-3KHV9/5R:5-CAC AAG TTC AGT CTG TTC CTC AA-33.7异丙醇:分析纯,使用前预冷到一20℃。3.8矿物油：要求无DNA酶和 RNA酶，用于无热盖的 PCR扩增仪。3.9分子量标准：推荐使用pUC19DNA/MspI（HpaⅡ），各片段大小依次为501、404、331、242、190、147 bp。3.10 HEPES.4器材和设备4. 196孔细胞培养板。4.2倒置显微镜。4.3恒温培养箱。4.4普通冰箱和超低温冰箱。4.5组织研磨器。4.6离心机和离心管。4.7PCR扩增仪。4.8水平电泳仪。4. 9微量移液器及吸头。 SN/T 1674-20054.10紫外观察灯或凝胶成像仪。4.11制冰机。5 KHV 的分离5.1采样有临床症状的鱼,如是体长小于 4 cm 的鱼苗取整条鱼,体长 4 cm～6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）;体长大于6 cm 的鱼则取脑、肝、肾、脾;无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。按GB18088一2000的规定采样。5.2样品处理先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于培养液中。如果在勾浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有1000 IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液中，于15℃下孵育 2 h～4 h或 4℃下孵育 6 h～~24 h。7000 r/min离心15 min，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染，不必匀浆但需稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5. 3病毒分离KF细胞传代使用胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化液（见第A.1章）。对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1：10、1：100、1：10003个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约 24 h 的KF细胞单层中,每孔的细胞单层最多接种100uL稀释液。15℃～20℃吸附0.5 h～1 h后，加人细胞培养液（见第A.2章）。置于24℃士2℃培养。试验设2个阳性对照（接种KHV标准株）和 1个空白对照(未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外,没有 CPE出现,则在培养 7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000 r/min，4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天