NY_T 562-2015动物衣原体病诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 562-2015代替NY/T562—2002动物衣原体病诊断技术Diagnostic techniques for animal chlamydiosis2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 562—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准代替NY/T562一2002《动物衣原体病诊断技术》。本标准与NY/T562一2002相比，病原检测部分增加了血清学诊断技术和PCR诊断技术。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：周继章、曹小安、宫晓炜、陈启伟、郑福英、李兆才、邱昌庆、殷宏。本标准的历次版本发布情况为：-NY/T562—2002。I NY/T562—2015动物衣原体病诊断技术1范围本标准规定了动物衣原体鸡胚分离与传代培养技术、血清学诊断技术及PCR诊断技术。本标准适用于实验室动物衣原体的分离、传代培养和动物衣原体病的诊断。其中，血清学直接补体结合试验（DirectComplementFixation Test，DCF)适用于哺乳动物（猪除外）和鹦鹉、鸽（7岁以上老龄鸽除外）衣原体病的诊断；间接补体结合试验（IndirectComplementFixationTest，ICF）适用于禽类（鹦鹉、鸽除外，但包括老龄鸽）和猪衣原体病的诊断；间接血凝试验（IndirectHemagglutination Test，IHA)适用于动物衣原体病的产地检疫、疫情监测和流行病学调查；PCR诊断技术适用于牛、羊、猪和禽衣原体病的诊断。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1工作量抗原workloadantigen能发生完全反应的抗原量的单位，能与最高稀释度的血清呈现完全抑制溶血反应的最高抗原稀释度即为1个工作量抗原的效价。2. 2 指示血清serumdirected与该抗原相应的哺乳动物抗血清。试验中测定的最高的标准血清稀释度即为1个工作量指示血清的效价。2. 3补体结合试验complementfixationtest，CF抗体与抗原反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。以往多用于病毒学检测。2. 4间接血凝试验indirect hemagglutination test,IHA将抗原(或抗体)包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体(或抗原)结合，从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。3动物衣原体的分离与培养3.1试验材料疑似或确定为衣原体感染的样本、鸡胚、孵化箱、无菌操作间、生物安全柜、冰箱、照蛋设备、鸡胚气室开孔器、注射器、6号针头、离心机、碘酊、70%酒精、链霉素、卡那霉素、生理盐水等。3.2材料要求3.2.1样本采集采集的样本应无杂菌污染，包括肝脏、脾脏、流产胎儿胃液、胎衣、流产分泌物等，其中流产胎儿的胃液为首选样本。样品进行涂片姬姆萨染色（见附录A），油镜下观察疑似有衣原体染色颗粒（原生小体，EB)为紫红色，大小0.2μm～0.6 μm;网状体(RB)为蓝黑色，直径为0.6μm～1.8 μm。样本在室外或1 NY/T 562—2015常温条件下放置时间不应超过72h，采集的样本应尽快放置于一20℃冰箱备用。如需较长时间保存，应置于一80℃超低温冰箱。3.2.2鸡胚要求分离培养衣原体用的鸡胚最好为SPF受精鸡蛋孵育，或者受精鸡蛋至少应来自无衣原体抗体且不使用氨芊类抗生素、四环素类抗生素、广谱抗菌抗病毒类药物的健康鸡群。3.2.3环境要求衣原体的分离培养应在实验室内进行，少量的接种分离培养在生物安全柜内操作即可。如果接种鸡胚的数量较大，生物安全柜不能满足要求，应在无菌操作间内进行。鸡胚接种前后均在孵化箱内孵育，保证相对稳定的发育温度和湿度。3.3试验方法3.3.1样本的处理将镜检发现疑似衣原体颗粒，或确定为衣原体且无杂菌污染的液体样本用灭菌生理盐水1：4稀释。如果是组织等样本，按体积大小用灭菌生理盐水1：4稀释后进行研磨破碎处理，3000r/min离心20min，在4℃冰箱中稳定4h左右备用。对疑似污染的样本研磨粉碎后，用含链霉素（1mg/mL）和卡那霉素（1mg/mL）的生理盐水1：4稀释，3000r/min离心20min，取其上清液以4000r/min～6000r/min再离心，取上清液4℃冰箱稳定4h左右备用。3.3.2鸡胚的准备试验前7d，应将分离用的受精鸡蛋放人孵化箱孵育。弃去过大、过小、破壳、软壳、畸形壳蛋等，形成7日龄发育的鸡胚。接种前1d，应弃去发育不良及死亡胚体，选择发育良好的鸡胚，划定气室及标记发