NY_T 1670-2008猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程.pdf

ICS 65.020.30B 44NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1670—2008猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程Detection procedures for haplotypes of estrogen receptor follicular stimulating hormone beta subunit gene in pigs2008-10-01实施2008-08-28 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1670—2008前言本标准的附录A为规范性附录，附录B、附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：全国畜牧总站、中国农业大学。本标准主要起草人：李宁、正志刚、刘丑生、张桂香、于福清、韩旭、孙秀柱。-I NY/T 1670—2008猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程1范围本标准规定了猪雌激素受体（ESR)和卵泡刺激素β亚基(FSHβ)基因单倍体型检测规程。本标准适用于猪ESR基因型和FSHβ基因型的单独或合并定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP以限制性内切酶处理DNA产生的片段长度变化为依据的一种遗传标记。4原理雌激素受体基因是控制猪产仔数的主效基因之一,ESR BB基因型与产仔性状呈正相关,AA和AB基因型个体的产仔性状次之。ESR基因座等位基因的差异是由于B等位基因发生点突变，从而产生一个PuuIⅡI限制性酶切位点。卵泡刺激素β亚基（FSHβ)基因也是控制猪产仔数的主效基因之一，FSHBBB基因型与产仔性状呈正相关，AA和AB基因型个体的产仔性状次之。猪FSHB基因等位基因的差异是由于Λ等位基因在FSHβ基因的第1个内含子中存在1个292bp的逆转座子插人突变（Λ等位基因扩增片段为500bp,B等位基因为218bp)。ESR和FSHβBB-BB单倍体型与产仔性状呈正相关,其他基因型个体的产仔性状次之。为了同时选择同效应基因型，针对 ESR基因和FSHβ基因的侧翼设计引物，进行扩增，通过检测带型分布鉴别猪个体ESR和FSHIβ单倍型。5试剂和仪器设备5.1试剂以下试剂无特殊标注均为分析纯。5.1.1血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液。5.1.2Tris饱和酚：重蒸。5.1.3二氯甲烷。5.1.4异戊醇。5.1.5无水乙醇。5.1.6溴化乙锭（10mg/mL）。 NY/T 1670--20085. 1.7TBE或TAE电泳缓冲液。5.1.86×上样缓冲液。5.1.9琼脂糖。5.1. 10 RNA 酶(10 mg/mL)。5.1.11蛋白酶K(20mg/mL)。5.1.12无水碳酸钠。5. 1. 13dNTPs:dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP。5. 1. 14 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)。5.1.15限制性内切酶PuuⅡI（10U/μL）。5.1.16：DNA分子量标记。5. 1.17试剂的配方和配制见附录A。5.2仪器设备5.2.1凝胶成像分析系统。5.2.2 PCR扩增仪。5.2.3水平电泳槽。5.2.4离心机。5.2.5涡旋震荡器。5.2.6可调移液器。5.2.7#稳压稳流电泳仪。5.2.8走超净工作台。5.2.9走超纯水器。5. 2. 10高压灭菌器。6检测方法6.1样品的收集与保存6.1.1采样个体应具备该品种的典型特征，每品种采集要求三代内无血缘关系的个体不少于60头，其中雄性数量不少于10%。6.1.2样品的采集及保存应满足提取DNA的要求，并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件。6.1.3DNA样品的制备与检测参见附录B。6.2引物合成和配制6.2.1引物序列ESR引物序列上游引物 F15- CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG- 3下游引物 R15-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3°FSHβ引物序列上游引物 F25-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3下游引物R25-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3将引物管进行瞬时离心，加入灭菌双蒸水充分震荡5min～10min，室温充分溶解30min，分装，一20℃冻存。2 NY/T 1670--20086