NY_T 2417-2013副猪嗜血杆菌PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2417-2013副猪嗜血杆菌PCR检测方法Polymerase chain reaction (PCR) for detection ofHaemophilus parasuis2013-09-10 发布2014-01-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2417—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所本标准主要起草人：逐忠新、贺英、储岳峰、赵萍、高鹏程。I NY/T2417—2013副猪嗜血杆菌PCR检测方法1范围本标准规定了检测副猪嗜血杆菌（Huemophiluspurasuis.HPS）的聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction.PCR)技术本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测。2材料准备2.1器材PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mI.PCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2试剂NET缓冲液（配制方法参见A.1）、TAE电泳缓冲液（配制方法参见A.2）、RNaseA酶、蛋白酶K、TuqDNA聚合酶（5U/uL）、10XPCR缓冲液（含Mg：）、脱氧三磷酸核背酸混合液（dNTPs，各2.5mmol/uL）、125bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚-一氯仿一异戊醇（25：24：1）、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠（Na.EDTA）、冰醋酸、氯化钠、溴酚蓝、溴化乙锭、I二烷基硫酸钠（SDS）、灭菌超纯水。2.3引物引物序列:F1：5-TATCGGGAGATGAAAGAC-3;F2：5-GTAATGTCTAAGGACTAG-3”；Revx：5-CCTCGCGGCTTCGTC-3。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20umol/I。靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。2.4样品采集2.4.1气管分泌物用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物，放人无菌试管中。2.4.2肺脏无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。2.4.3关节液若有关节囊肿.在囊肿部位表面常规碘消毒.用2ml.或5ml.灭菌注射器穿刺.无菌吸取1ml~2ml.关节渗出液。2.4.4采集的样品应在4℃条件下立即送到实验室。2.5DNA提取2.5.1样品处理气管分泌物拭子将每支拭子浸入1mlL～2mlNET缓冲液中30min，反复挤压。将浸出液经4℃7500g离心15min后，弃上清。收集沉淀.用1mLNET缓冲液重悬。肺组织将肺组织样品剪碎，按1g加人0.9mLNET缓冲液研磨后.用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于2ml.灭菌离心管，4℃7500g离心15min.弃上清。收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬1 NY/T 2417—20关节液将500μl关节液和500ul.NET缓冲液等体积混匀后.4℃7500g离心20min，弃上清.收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。2.5.2DNA的提取方法取2.5.1中制备的样品悬液500uL.加入100ul.20%的SDS（终浓度3.4%），混匀。在95℃~100℃孵育10min后.迅速放置于冰上冷却10min～15min。在样品中加RNaseA至终浓度为40μg/ml..50℃水浴30min。然后，加人蛋白酶K至终浓度为200μg/ml.50℃水浴30min。加人等体积的酚一氯仿一异戊醇（25：24：1），手颠倒摇匀2次～3次.4℃9000g离心10 min。转移上清液于另一离心管中。重复、操作过程，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，手颠倒摇匀2次～3次，一20℃沉淀30min，4℃12000g离心10min，弃去液相。用1mL.70%乙醇漂洗，4℃12000g离心2min，弃上清，真空或室温下干燥DNA沉淀DNA沉淀用25μL～50μL无菌超纯水溶解作为模板，保存在一20℃备用。3PCR试验3.1反应体系10XPCRbuffer(含Mg²-)5 μL脱氧三磷酸核背酸混合液（dNTPs）4 μl,F1引物和F2引物各0.5μlRevx引物1 μl2 μl模板（被检样品总DNA）36.5 μL无菌超纯水0.5 μl.TuqDNA聚合酶样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照，阳性对照模板为靶基因（副猪嗜血杆菌16SrRNA基因片段)重组质粒，空白对照为灭菌超纯水。3.2PCR反应程序94℃变性3min，然后35个循环.分别为：94℃变性1min，56℃迟火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min.4℃保存。3.3电泳3.3.11%琼脂糖凝胶板的制备