NY_T 3313-2018生乳中β-内酰胺酶的测定.pdf

ICS 67.100.10X 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T乳中β-内酰胺酶的测定Determination of β-lactamase in raw milk2019-06-01实施2018-12-19 发布中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3313—2018前言言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：郑楠、刘慧敏、屈雪寅、王加启、李松励、杨晋辉、赵晨、文芳、祝杰妹、叶巧燕I NY/T 3313-2018生乳中β-内酰胺酶的测定1范围本标准规定了生乳中β-内酰胺酶测定的杯碟法和胶体金快速试纸条法。本标准适用于生牛乳、生羊乳、生水牛乳中β-内酰胺酶的测定。本标准第一法检出限为生牛乳4U/mL、生羊乳3U/mL、生水牛乳1U/mL；第二法检出限为4U/mL.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T3051—2016生乳安全指标监测前样品处理规范第一法杯碟法3原理采用对青霉素药物敏感的藤黄微球菌，通过舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，以青霉素作为对照，比较加入舒巴坦与未加人舒巴坦的样品产生的抑菌圈大小，间接测定样品中是否含有β-内酰胺酶。4试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂4.1水:GB/T 6682,三级。4.2磷酸盐缓冲液(pH6.0)：称取8.0g无水磷酸二氢钾、2.0g无水磷酸氢二钾，溶解于水中，用盐酸溶液（0.1mol/L）调节pH至6.0，定容至1L，121℃高压灭菌15min。4.3生理盐水（8.5g/L）：称取8.5g氯化钠，溶解于1L水中，121℃高压灭菌15min。4.4菌悬液：将试验菌株［藤黄微球菌（Micrococcusluteus）CMCC（B）28001，又名嗜根考克氏菌（Kocuriarhizophila）CICC10445］接种于营养琼脂培养基（4.8）斜面上，经生化培养箱（5.1）培养18h24h，用生理盐水（4.3)洗下菌苔即为菌悬液。菌悬液浓度用光度计测定，在450nm测量其200倍稀释液，吸光度值约为0.89，即终浓度约为1X101°CFU/mL。菌悬液现用现配。4.5β-内酰胺酶标准溶液（4000U/mL）：用磷酸盐缓冲液（4.2)将β-内酰胺酶标准品（300万U/mL)制备成浓度为4000U/mL的标准溶液。现用现配。4.6舒巴坦标准溶液（1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.1mg）舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲液（4.2）溶解并定容至10mL。现用现配4.7青霉素标准溶液（0.1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.1mg）青霉素参考标准物质（PenicillinGSodium，青霉素G钠盐），用磷酸盐缓冲液（4.2）溶解并定容至100mL。现用现配。4.8营养琼脂培养基：见附录A中的A.1。4.9抗生素检定培养基IⅡ：见A.2。1 NY/T 3313—20185仪器设备5.1生化培养箱：±1℃。5.2高压灭菌锅。5.3光度计：450nm。5.4 pH计：精确至0.1。5.5移液器:1mL,200 μL,10μl。5.6天平：感量0.1mg。5.7恒温水浴锅：士1℃。5.8抑菌圈测量仪或游标卡尺：精确至0.01mm。5.9牛津杯：不锈钢小管，外径(8.0士±0.1)mm，内径（6.0士0.1)mm，高度（10.0±0.1)mm。5.10培养皿：内径90 mm。5.11离心管：1.5mL。6样品样品应按NY/T3051一2016中3.4.5规定的要求冷藏或冷冻保存，恢复室温后进行测定。7试验步骤7.1检验用平板的制备将菌悬液（4.4)按适当比例加人灭菌后冷却至（46士1)℃的抗生素检定培养基ⅡI（4.9)中，充分摇匀后制备菌体数量约为1X10°CFU/mL的含菌培养基；取15ml～20mL含菌培养基倒人无菌培养血皿（5.10），凝固后备用。7.2试样的测定各取1.00mL充分混匀的生乳于4个1.5mL离心管（5.11)中，分别标为A、B、C、D。每个样品平行试验2个。同时，用灭菌水作空白试验。按照表1依次分别加人β-内酰胺酶标准溶液（4.5）、舒巴坦标准溶液（4.6）、青霉素标准溶液（4.7）。混匀后，取A～D试样各200μL分别加入到放置于检验用平板（7.1）上的4个牛津杯（5.