SNT 2462-2010棉花曲叶病毒检疫鉴定方法.pdf

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2462—2010棉花曲叶病毒检疫鉴定方法Identification of cotton leaf curl Begomovirus2010-01-10 发布2010-07-16实施HO中华人民共和国发布智示提线21985查法真国家质量监督检验检疫总局，数码防伪 SN/T前本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、浙江大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：张祥林、周雪平、朱水芳、王、吴卫、余永杰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 SN/T 2462-—2010棉花曲叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Begomovirus,简称 CLCuV)的检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有棉花曲叶病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。2原理棉花曲叶病毒的分类地位属双生病毒科（Geminiviridae）、菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。该病毒的生物学特性、血清学特性和分子生物学特征是制定本标准的主要依据(参见附录 A)。3仪器设备和用具3.1仪器设备电子天平（感量1/1000g)、超净工作台、高速冷冻离心机、小型低速离心机、pH计、恒温水浴锅、微量榨汁机、超低温冰箱、高压灭菌器酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等。3.2用具研钵、培养皿、可调式微量移液器(2μL、10°μL、20 μL、100 μL、290μL、1000 μL)及相应的移液器头、96孔酶联反应板、离心管（1.5lmL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子。4试剂、缓冲液及溶液4.110 ×PBST缓冲液氯化钾(KCI)2g、氯化钠(NACI)80g/磷酸二氢钾(KH2PO4)2g)磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)11.5g、吐温20(Tween-20)5mL,用浓盐酸(HCI)调节,pH至7.4,加蒸馏水定容至1000mL,4℃条件下贮存。4.2样品提取缓冲液4g000,PVP)20 g、叠氮钠(NaN3)亚硫酸钠（Na2SO3）1.3g/聚乙烯基吡咯烷酮（MW0000.2g、吐温20(Tween-20)20mL溶解于:800·mL1＊PBST中，用盐酸调节pH至7.4，加1×PBST定容至1000 mL,4℃条件下贮存。4.3包被缓冲液碳酸钠(Na2CO3）1.59g、碳酸氢钠（NaHCO:）2.93g、叠氮钠（NaNs)0.2g，用浓盐酸（HCI)调节pH至 9.6,加蒸馏水定容至1000mL,4℃条件下贮存。4.4洗涤缓冲液将1×PBST缓冲液用浓盐酸(HCI)调节 pH至7.4,4℃条件下贮存。4.5酶标抗体缓冲液1XPBST缓冲液800mL、小牛血清白蛋白（BSA)2g、聚乙烯基吡咯烷酮20g、叠氮钠（NaN3）0.2g，用无菌蒸馏水定容至1000mL,4℃条件下贮存。4.6底物(PNPP)缓冲液二乙醇胺97mL、叠氮钠（NaN3）0.2g，用浓盐酸（HCl)调节 pH至 9.8,用无菌蒸馏水定容至1000mL,4℃条件下贮存。4.7 底物(PNPP)溶液将4-硝基酚磷酸钠盐(PNPP)100mg溶解于 PNPP底物缓冲液100mL中，现配现用。1 SN/T 2462—20104.8终止反应液氢氧化钠（NaOH)40 g，用无菌蒸馏水定容至1000 mL。4.9提取缓冲液A葡萄糖60g、NaDIECA 23g、聚乙烯基吡咯烷酮20g、巯基乙醇0.8mL,溶解于 1000 mL蒸馏水中，常温下贮存。4.10　提取缓冲液B10 mmol/L Tris-盐酸、20 mmol/L EDTA、0.5mol/L氯化钠、1.5%SDS,pH8.0。4.1110×PCR缓冲液10 mmol/L Tris-盐酸,10 mmol/L氯化钾。4.12TAE电泳缓冲液40 mmol/L Tris-Ac,2 mmol/L Na2 EDTA.4.13其他试剂液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、SYBR Green I。也可采用棉花曲叶病毒检测试剂盒。5检疫鉴定方法5.1双抗体夹心法（DAS-ELISA)）5.1.1样品制备取同一批次表现症状的寄主植株叶片和无症状叶片进行混合取样，用微量榨汁机或研钵研磨样品，其中加入样品提取缓冲液，植株叶片质量与样品提取缓冲液为1：5（g/mL）。将榨出的汁液分别盛装于Eppendorf 管中，4 000 r/min离心5 min 后吸取上清液待用。5.1.2操作步骤根据检测需要设计96孔酶联板点样孔。包括 2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个～4个空白对照孔和多个待检测样品孔