SN_T 1142-2011马病毒性动脉炎检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1142—2011代替 SN/T 1142—2002,SN/T 1377—2004马病毒性动脉炎检疫技术规范Quarantine protocol for equine viral arteritis2011-12-01 实施2011-05-31 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1142—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1377—2004《从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程》和SN/T1142—2002《马病毒性动脉炎微量血清中和试验操作规程》。本标准与SN/T1142—2002和SN/T1377--2004相比，主要的技术变化如下：增加了血液、组织中的病毒分离;增加了酶联免疫吸附试验方法；增加了荧光 RT-PCR试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、郑小龙、李西峰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1142--2002;SN/T SN/T 1142-2011马病毒性动脉炎检疫技术规范1范围本标准规定了马病毒性动脉炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和荧光 RTPCR试验等方法。本标准适用于进出境马属动物病毒性动脉炎的诊断和检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008　实验室　生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。RK-13:兔肾细胞PBS:磷酸盐缓冲生理盐水CPE:细胞病变反应EAV:马病毒性动脉炎病毒TCIDso:半数组织感染量ELISA：酶联免疫吸附试验Realtime RT-PCR:荧光反转录-聚合酶链式反应4临床诊断4.1临床特征发病马的临床症状表现不一，一般为发热，精神沉郁，食欲不振，流鼻液，流泪，结膜炎，眼脸水肿，颔下淋巴结肿大，白细胞减少，四肢特别是后肢下端水肿，雄马阴囊及包皮肿胀，妊娠马流产。老龄雌马和营养状况差的马临床症状较重,妊娠马比空怀雌马症状明显。如果妊娠马群发生 EAV流行，流产率可高达 40%～59% 。4.2判定根据4.1临床检查可作出初步判定，确诊需进行实验室检测。 SN/T 1142--20115 病毒分离鉴定5.1仪器设备超净工作台或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、蔡氏滤器和微孔滤膜（0.22um）、高压灭菌锅、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板（96孔）、微型振荡器、微量可调移液器(200 μL）、电子天平、细胞瓶和吸管(1 mL、2 mL、5mL、10 mL)等。5.2试剂与材料MEM培养基、抗生素贮存液、细胞消化液细胞培养液和细胞维持液、1%细胞染色液、7.5%羧甲基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（PBS）、兔肾细胞（RK-13）、马病毒性动脉炎病毒（EAV)标准病毒株(Bucyrus株）和各种常规试剂等试剂配制见附录A。5.3样品采集与处理5.3.1样品采集与运送无菌采集动物抗凝全血（不宜用肝素作抗凝剂），死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放入冰盒中→尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验室，组织样品冷冻于一20℃以下保存（抗凝全血样品4℃保存）。5.3.2样品处理全血样品的处理：取抗凝血加人 2倍～3倍体积红细胞裂解液，混匀静止 4 min～5 min，待红细胞完全破碎，1500r/min离心5min弃上清液除去破碎的红.细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞.则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加人PBS缓冲液，制成自细胞悲液，反复冻融两次，低温（一20℃）保存备用。动物组织样品的处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌容器内，加入少量维持液，用灭菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为19%的组悬液。以2000r/min离心10min，收取上清液低温（一20℃）保存备用。动物精液的处理：将精液超声波裂解三次（30dw），次15=：然后在4℃下2000r/min离心10 min，沉淀精子细胞，取上清液低温（-20℃）保存备用。5.4 病毒分离5.4.1将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液作细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种作阳性对照。5.4.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置