SN 1460-2004输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1460—2004输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法Detecting methods for west nile virus and St. Louisencephalitis virus in imported mosquitoes2004-11-17 发布2005-04-01实施中华人民共和国数码防仪发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1460—2004前 言本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国陕西出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、黄廷学、闫护森、施惠祥、卢岳云、杨定波。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1460—2004输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法1范围本标准规定了国境口岸输人性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测的生物安全要求、检测对象、检测方法、结果的报告、阳性结果处置。本标准适用于检验检疫机构对输人性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测和报告，对口岸发现的蚊类检测西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒也可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是未注明日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1输入性蚊类 imported mosquitoes通过人境交通工具、集装箱、货物及行李带人境内的库蚊、伊蚊属。3.2西尼罗病毒west nile virus,WNV为西尼罗热的病原体，属黄病毒科，黄病毒属。电镜下呈球形,有囊膜，40 nm～60 nm 的20 面体对称型单股正链 RNA病毒,约1000 bp～11000 bp。3.3圣路易脑炎病毒St.Louis encephalitis virus,SLEV为圣路易脑炎的病原体,属黄病毒科,黄病毒属的 RNA病毒。4 检测对象输人性蚊类。5生物安全要求下列操作必须在生物安全3级(BSI.3)实验室中进行：用蚊胸腔接种的方法分离病毒；收集或浓缩病毒或其培养产物；可能产生含病毒气溶胶的样品处理；一离心管和离心机转头的封闭和开启。 SN/T 1460--20046 病毒核酸分子检测一逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)6. 1 器材与试剂6.1.1器材PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱（一80℃）、组织研磨器、电动匀浆器、离心机和离心管、倒置显微镜、PCR管、剪刀、镊子。6. 1.2 试剂 水应符合GB/T 6682中一级水的规格。用于 PCR(包括核酸抽提）时所用的水必须是无RNA酶的水。6. 1. 2. 2 Tag DNA 聚合酶-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。6. 1.2.3逆转录酶一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。6. 1.2. 4 RNA 抑制剂(RNasin)--20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 dNTP含 dCTP、dGTP,dATP,dTTP 各 10 mmol/L. 引物6. 1.2.6. 1 西尼罗病毒引物浓度为20 umol/L，可根据要求选择其中一对引物,其序列分别如下：a）引物对1如下：-上游弓引物 WNENV—forward:5*-TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3;-下游弓l物WNENV—reverse:5-GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-3。b）引物对2如下：-上游弓引物 WN233:5′-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCGTTCTT-3”;-下游弓引物WN640c:5°-CAGCCGACAGCACTGGACATTCATA-3。c）引物对3如下：-上游引物 WN3NC—forward:5*-CAGACCACGCTACGGCG-3*;-下游引物 WN3NC—reverse:5′-CTAGGGCCGCGTGGG-3。.2圣路易脑炎病毒引物浓度为 20 umol/L，可根据要求选择其中一对引物，其序列分别如下；引物对1如下：a）-上游引物 SLE727:5-GTAGCCGACGGTCAATCTCTGTGC-3;一下游引物 SLE1119c:5-ACTCGGTAGCCTCCATCTTCATCA-3。b）引物对2如下：-上游引物 SLE1637:5°-GACGAGCCCTGCCACAACTGATT-3’;下游弓物 S