SN_T 4419.9-2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第9部分：栗子.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4419.9--2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法　第9部分：栗子Food allergen detection with LAMP methods for export-Part 9 :Chestnut2016-10-01 实施2016-03-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.9—2016前言SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：第1部分：开心果；第2部分：腰果；第3部分：胡桃；第4部分：榛果；第5部分：杏仁；第6部分：扁桃仁；-第7部分：巴西坚果；;-第8部分：澳洲坚果；第9部分：栗子；第10部分：大豆；第11部分：羽扇豆；第12部分：花生；第13部分：葵花籽；第14部分：芝麻;第15部分：大麦；一第16部分：小麦；第17部分：芥麦；第18部分：芥末；第 19部分:胡萝卜；一第20部分：芹菜；第21部分：牛奶；第22部分：虾。本部分为SN/T 4419的第9部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局本部分主要起草人：谢力、凌莉、陈源树、刘津、韩建勋、陈颖、高东微、李志勇、刘青、席静、关丽军。 SN/T 4419.9-—2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法　第9部分：栗子1范围SN/T4419的本部分规定了食品中过敏原栗子成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法。本部分适用于食品及其原料中过敏原板栗（Castaneamollissima）和锥栗［Castaneahenryi（Skan）Rehd.et Wils.I成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检测限（ILOD)为0.5%（质量分数）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403--2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1过敏原allergen又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原，3.1.2栗子 chestnut栗子，又名栗，壳斗科栗属植物可食用种类的种仁，主要包括板栗（Castaneamollissima）和锥栗[Castaneahenryi(Skan )Rehdet Wils.].3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)LAMP环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification)Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定。1 SN/T 4419.9--20165方法提要样品经研磨后，提取 DNA，以 DNA 为模板，采用栗子 leafy-like protein mRNA基因特异性检测引物进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原栗子成分。6LAMP检测方法6.1原理根据栗子 leafy-like protein mRNA基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在链置换型Bst DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链合成，在同链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg?+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBR GreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时,荧光信号是游离状态的800～1 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR GreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2仪器和设备6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃±1℃。6.2.27离心管:0.1 mL、1.5 mL。6.2.3计时器。6.2.4 移液枪:量程0.5 μL～10 μL、量程 10 μL～100 μL、量程 100 μL～