SN_T 4827-2017蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4827—2017蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范Quarantine protocol for Chryseobacterium meningosepticum of frog2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布*国家质量监督检验检疫总局tw315余层套真饼 SN/T 4827-2017言前本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：徐淑菲、孔繁德、谢明星、唐泰山、王凯民、姜焱。 SN/T 4827--2017蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范1 范围本标准规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学、PCR等实验室诊断、检测方法。本标准适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3试剂和培养基除另有规定外，以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。3.1营养肉汤。3.2胰蛋白陈大豆琼脂(TSA)。3.3硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)。3.4营养琼脂。3.5生化鉴定试剂盒。3.6革兰氏染色液。3.7DNA 提取试剂：蛋白酶 K、SDS、酚-氯仿抽提法所需要的相关试剂；商品化的 DNA提取试剂盒。3.8PCR试剂：10X浓缩缓冲液、dNTP、氯化镁、6×电泳上样缓冲液、琼脂糖、5×电泳缓冲液(TBE)等，均为商品化试剂盒中成分。3.9引物:a）特异性引物：---P1: 5′-GATTCGTCGGATTATATTG3;P2:5-CCACTTCAACCTTACTCAAGACTAAC-3。浓度为10 μmol/L，扩增产物大小为475bp～479bp。b）通用引物：-P3:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;P4:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3。浓度为10 μmol/L，扩增产物大小为1488 bp。阴性和阳性对照：由国家质检总局指定实验室提供。3.103.11DNA DL2000 Marker:适合检测分子量大小100 bp～2000 bp间的 DNA片段，－20℃保存。4疾病概述蛙脑膜炎败血金黄杆菌病，是由脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）引起1 SN/T 4827—2017蛙、鳖等多种水生动物的-一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鳖等各种养殖蛙类和鳖类，蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月～10月为主要的发病季节;室内恒温养殖情况下，发病季节不明显。病蛙出现运动机能失调、头部歪斜、身体失去平衡或浮于水面打转等，眼部因感染出现白色坏死（白内障)症状，同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。取濒死发病蛙内脏或脑部组织，涂片，镜检，可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。5设备和材料5.1 天平。5.2离心机。5.3微量移液器。5.4凝胶成像仪或紫外透射仪。5.51PCR仪。5.61恒温培养箱。5.7冰箱。5.8显微镜。6检测方法6.1丝细菌学检测方法6.1.1取样按照GB/T18088的规定采样。取发病蛙眼、脑、肝脏等组织作为样品。6.1.2操作步骤增菌无菌取待检样品 25g，加人营养肉汤 225ml，用均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min;或置于盛有 225 mL营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，于28℃±1℃培养 18 h～24 h。分离培养将上述经过增菌的培养物，用无菌接种环分别划线接种到TSA、TCBS、营养琼脂等平板上，于28℃士1℃培养 18 h～24 h。典型菌落特征：在 TSA 上，菌落直径 1 mm～2 mm,圆形突起，有光泽，呈白色、微黄或亮黄色；在TCBS上，菌落呈绿色；在营养琼脂平板上，菌落呈微黄或亮黄色。脑膜炎败血伊丽莎白菌可在37℃生长，但无明显色素形成。挑取典型菌落，接种营养肉汤或其他培养基作为纯培养物，用于后续试验。革兰氏染色镜检取干净的载玻片，用接种环挑取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均勾；晾干载玻片；按照说明书用革兰氏染色试剂（见A.1、A.2)进行染色。显微镜下观察，脑膜炎败血伊丽莎白菌为革兰氏阴性、细长、末端略圆突的杆菌，大小（