SN 1445-2004动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1445-2004动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验Micro-hemagg!utination inhibition for Japanese encephalitisvirus of animals2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布R ADDE国家质量监督检验检疫总局，数码防伪， SN/T 1445--2004前言本标准的附录 A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李树清、胡永强、李健、徐红。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1445—2004动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验1范围本标准规定了微量血凝抑制试验检测动物流行性乙型脑炎抗体的方法。本标准适用于动物流行性乙型脑炎的检疫、流行病学调查和免疫监测。2 材料2. 1 试剂2. 1.1 磷酸氢二钠(Naz HPO. ·12H,O)。2. 1.2磷酸二氢钠(NaH,PO·2H2O)。2.1.3氯化钠（NaCl）。2. 1.4 枸橼酸钠(Na:C,H,O, ·2HzO)。2. 1.5枸橡酸(H.C.H,O,·H2O)。2.1.6葡萄糖(C H1zOs·HzO)。2.1.7硼酸(H;BO:）。2.1.8氢氧化钠(NaOH)。2. 1. 9牛血清白蛋白(BSA)。2. 1. 10白陶土。2. 1. 11红细胞保存液、生理盐水、pH 9. 0 硼酸盐溶液(BS)、0. 4% pH 9.0 牛血清白蛋白硼酸盐溶液(BABS)、红细胞稀释液、白陶土溶液的配制见附录 A。注：所有化学试剂均为分析纯。2.2仪器设备2.2.1$96孔U型微量反应板。2.2.2多通道、单通道可调移液器及加样头。2.2. 310 mL无菌注射器。2.2.4离心管。2.2.510 mL和1 mL吸管。2.2. 6天平(0. 000 1 g)。2.2.7水浴锅。2.2.8普通冰箱。2.2.9恒温箱。2.2.10微型振荡器。2. 2. 11酸度计。2.2. 12普通低速离心机。2.3 标准试剂2.3. 1 流行性乙型脑炎血凝素。2.3.2流行性乙型脑炎阳性血清。2.3.3流行性乙型脑炎阴性血清。 SN/T 1445--20042.4试验动物健康青年（4～16月龄)雄性鹅。3采样被检动物无菌采血 5 mL,待血液凝固后，以 2000 r/min离心10 min，分离血清，血清一20℃保存备用。4操作方法4. 1制备鹅红细胞悬液取10mL无菌注射器，先吸人红细胞保存液0.5mL，从鹅的翅静脉无菌采血5mL，立即注人盛有15 mL左右红细胞保存液的容器中,不时摇动,3 min后置 4℃冰箱过夜。次日将红细胞倒人离心管平衡后2000r/min离心5min，弃去上清液，离心管中加人10倍量生理盐水轻轻混匀，20001/min离心5min，如此反复三次，第三次用同样的速度离心10min，尽量吸去上清液。用1mL吸管插人离心管内红细胞泥的中心部，吸取所需的红细胞，用生理盐水配成8%的红细胞悬液，余下的红细胞泥4℃保存备用。再分别用pH 6.0、pH 6.2、pH 6.4、pH 6.6、pH 6.8的红细胞稀释液将8%的红细胞悬液作 24倍稀释，制成0.33%工作浓度不同pH值的红细胞悬液。4.2处理被检血清取血清0.1mL，加25%的白陶土0.5mL，振荡混匀，置37℃1h或4℃过夜。加人pH9.0的BS液0.4mL，摇匀后2500r/min离心30min，取上清56℃灭能30min。加鹅红细胞泥0.05mL，混匀，置37℃恒温箱反应20min。1500r/min离心10min，保留上清液，弃沉淀。此上清液郎为1：10稀释度的被检血清。4. 3 测定血凝素的最适 pH 值4.3.1取96孔U型微量反应板，按表1标记。每孔均如人25LBABS,每排的第一孔加人25μL血凝素，混匀后吸25μL至第二孔作等量倍比稀释至倒数第二孔，并从倒数第二孔中吸去 25 μL。最后孔不加血凝素作为红细胞对照。4.3.2每孔加BABS25μL，充分摇匀，室温(20℃～25℃)放置30 min～60min。4.3.3各排每孔分别加人不同pH0.33%工作浓度的红细胞悬液50μL，摇匀后，37℃放置1h，判断结果,举例见表1。表 1血凝素最适 pH 测定结果1011679012血凝素的稀释度不同pH的红细红细胞１:128↓１2561:41:81￥1611321: 641: 5121:1 0241*20481+2胞悬液对照#x6.0#+6. 2#####++##6.4#########6.6####++6.8#?注1：#表示红细胞已100%凝集，呈一层薄膜状，凝集