SNT 1874-2007猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1874--2007猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for porcine parvovirus2007-04-06 发布2007-10-16 实施中华人民共和国发布 国家质量监督检验检疫总局数码防摄 SN/T 1874—2007前言本标准的附录 A为规范性附录,附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：盘宝进、韦梅良、罗兆飞、汪文龙、刘军义。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1874—2007猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程 范围本标准规定了猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程。本标准适用于猪细小病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版叛本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。SN/T1193基因检测实验室技术要求３缩略语下列缩略语适用于本标准3.1PPV Porcine Parvovirus.猪细小病毒。3.2PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链反应。3.3DNA deoxyribonucleiclacid脱氧核糖核酸。3.4dNTPP deoxyribonucloside triphosphate acid脱氧核苷三磷酸。3.5dATPdeoxyadenosine triphosphoric acid脱氧腺苷三磷酸。3.6dGTP deoxyguanosine triphosphoric acid脱氧鸟苷三磷酸。3.7dCTP deoxycytidine triphosphate acid脱氧胞苷三磷酸。3.8dTTP deoxythymidine triphosphate acid脱氧胸苷三磷酸。3.9bp base pair；碱基对。 SN/T 1874--20073. 10EDTA Ethylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸。3.11SDS Sodium Dodecyl Sulfate十二烷基硫酸钠。3. 12Tris Tris(hydroxymethylamino)methane acetate三羟甲基氨基甲烷。3.13Na2-EDTA · 2H,O Disodium ethylenediamine tetraacetate二水乙二胺四乙酸二钠。4试验材料4. 1 试剂、溶液、缓冲液所有实验试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为二次蒸馏水或去离子水。4.1.11 mol/L Tris-CI缓冲液,pH8.0:见第 A.1 章。4.1.2 0.5 mol/L EDTA,pH8.0:见第 A.2 章。1 mol/L氯化钠(NaClI)溶液：见第 A.3章。4. TEN样品裂解缓冲液,pH7.5：见第 A.4章。4.1.520 g/L蛋白酶 K。4.1.6饱和酚。4.1.7三氯甲烷。异戊醇。.9无水乙醇。4.1.1075%乙醇。PCR 缓冲液。4.1.11dNTPs 含 dATP,dTTP,dCTP,dGTP 各 10 mmol/L。.13DNA 聚合酶 10 U/μL。4.1.14溴化乙锭10 mg/mL。4.1.15DNA分子量标记。4.1.16琼脂糖。4. 1.17.RNA 酶 10 mg/mL。4.1.18DNA 抽提试剂盒。4.1.19PCR扩增产物纯化试剂盒。10%SDS:见第A.5章。4.1.20TE缓冲液,pH8.0:见第 A.6 章。.2250×TAE缓冲液：见第A.7章。4.1.2310×上样缓冲溶液：见第A.8章。4.1.24引物：见第A.9章。猪细小病毒毒株：一20℃以下低温冰箱保存。仪器和耗材PCR仪。4.2.12 SN/T 1874---20074.2.2电泳仪。4.2.3电泳槽。4.2.4凝胶成像分析系统。4.2.5冷冻高速离心机。4.2.6匀浆器。4.2.7恒温水浴锅。4.2.8微波炉。4.2.9微量加样器。4.2.10微量加样器吸头。4.2.11天平,感量 0.001 g。4.2.12高压灭菌锅。4.2.13一20℃以下低温冰箱。4.2.14PCR反应管。 mL,5 mL,10 mL离心管。5操作方法实验室设施应达到SN/T 1193实验室技术要求。5.1 PPV 病毒株的复壮经胰酶消化长成单层的 PK-15 细胞，同步接种 PPV,待细胞完全病变后终止培养，一20℃以下反复冻融3次以上，收集病毒液备