SN_T 3296-2012植物病原细菌分子生物学检测规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3296--2012植物病原细菌分子生物学检测规范Criterion on detection of plant pathogenic bacteria by molecular biology2013-05-01实施2012-10-23 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3296—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邵秀玲、王有福、尼秀媚、厉艳、甘琴华、李鑫、刘卉秋、王晓明1 SN/T 3296—2012植物病原细菌分子生物学检测规范1 范围本标准规定了植物病原细菌分子生物学检测规范本标准适用于植物及其产品的细菌病害、分离纯化的植物病原细菌分子检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 27403　实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T 2601植物病原细菌常规检测规范3原理根据不同植物病原细菌基因组中的特异序列，利用分子生物学方法对病原菌进行鉴定，根据病原细菌侵染植物的发病程度及检测目标病原细菌的生物学特性及与近缘种区分难异程度不同，选择不同的分子生物学方法进行鉴定。4试剂与耗材4.1试剂植物基因组提取试剂盒、细菌 DNA 提取试剂盒、ddH,O、Tag酶、dNTP、常用荧光抗体、尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖、生理盐水等；常用细菌分离培养的培养基配方参见附录A。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。4.2耗材培养Ⅲ、试管、三角瓶、研钵、离心管（1.5 mL、1.0 mL）、PCR管（0.2 μL）、量筒、烧杯，剪刀、消毒缸等。5仪器设备5.1常规设备植物培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机（12000r/min）、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、电动搅拌器等。5.2PCR 方法主要设备PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、变性梯度凝胶电泳仪、电泳槽、毛细管电泳仪、凝胶成像分析1 SN/T 3296—2012仪、电子天平（感量0.0001g）、恒温水浴锅等。6实验室检测6.1　总则实验室总体要求与质控应符合SN/T1193；分子生物学方法的选择可参照以下原则：a）对于有针对病原细菌鉴定的特异性引物，并能很好地将病原细菌与其他近似种区分开来的检测目标，可采用普通 PCR法、巢氏 PCR法，或环介导等温基因扩增法等；b）对于较难区分鉴定的病原菌可采用基因组重复序列PCR、实时荧光定量PCR、分子标记法等；有标准明确规定的分子生物学检测法推荐参照标准方法c）6.2样品制备对于病灶明显的植物样本，可分离纯化疑似发病植物组织中的细菌，细菌分离与培养可按照SN/T2601进行。对于病症不明显的植物样本利用基因组提取试剂盒提取植物组织总DNA作为PCR的模版，提取方法可见基因组提取试剂盒说明。样品制备时，每个样品都应取至少2个平行样，进行重复性实验。6.3质量控制6.3.1总DNA样品质量控制琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性将提取的基因组DNA取2μI进行琼脂糖凝胶电泳检.基因组完整性较好的DNA样品电泳后将显现出一条明显而清晰的条带。如果在指示前沿溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在RNA杂质，若所提总DNA样品在0.5%琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而是弥散一片，则表明总DNA样品已严重降解。分光光度（紫外吸收）法检测DNA的浓度和纯度将待测DNA样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值，根据OD260/OD280的值比较所提取的总DNA的纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）二OD26×50×核酸稀释倍数。在紫外分光光度计下检查，纯的总DNA样品溶液的OD2s2／OD280的比值约为 1.8。若OD260/OD280的比值在1.8～2.Ol时-;表明DNA的纯度较好。若OD260/OD2s的比值大于2.0时，表明有RNA污染；若OD260/0D280的比值小于 1.8时表明有蛋白质或酚污染。通过计算调整 DNA的浓度，调整后用于 PCR扩增的 DNA模板浓度范围-般为 1 ng/μl～50 ng/μL；若提取的总DNA样品浓度较低，可以在后续过程中通过加大模板量，增加反应次数，或者采用二次PCR等方法来完成分子生物学检测。核