SNT 1908-2007泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1908-2007泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程Protocol of isolation and identification for parasite eggs oroocysts from kimchi and other plant foods2007-12-01实施2007-05-23发布中华人民共和国发布换盗国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1908--2007前 言本标准的附录 A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、曲径、葛建军、韩雪清、梅琳、刘建、贾广乐、曹际娟、李风琪。!本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。:1 SN/T 1908—2007泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程1范围本标准规定了泡菜等植物源性食品中寄生虫卵（包括蛔虫Ascaris、钩口线虫 Ancylostoma、毛尾线虫 Trichuris、毛圆线虫 Trichostrongylus 虫卵和等孢球虫Isopsopoa 卵囊等）的分离、形态学鉴定以及蛔虫卵的荧光 PCR 鉴定方法。本标准适用于泡菜、辣椒酱、烤肉酱等植物源食品中寄生虫卵检验时的制样、分离、利用显微镜进行形态学鉴定，以及对检测到的虫卵进行荧光 PCR准确鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1份样‧increment!从单个取样点一次抽取的少量样品2. 2原始样品bulk sample取自同一批的份样，经过混合而得到的一定数量样品。2.3试样 test sample由全部或部分原始样品经进一步均匀化得到的用于分析或测试的样品。2. 4存查样品 restore sample从原始样品中分取的用于备查的:一定数量样品2.5Ct 值 cycle threshold荧光PCR反应中，荧光信号到达设定的值所经历的循环数3主要试剂除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。3.1饱和氯化钠溶液取氯化钠（比重1.18～1.20)400g，加于1000mL水中，加热煮沸至氯化钠完全溶解即可。3.20.5%SDS 溶液称取 SDS(十二烷基磺酸钠)5.0g,加人1000mL水溶解即可。3.3荧光 PCR鉴定用试剂3.3.1蛔虫卵荧光PCR检测引物、探针，采用软件Beacon Designer设计，并进行BLAST分析，验证为虫超科寄生虫的通用引物和探针。3.3.2商品化的Real time PCR反应预混液。13.3.3阳性样品对照：采用猪虫雌虫，实验室内解剖,采集子宫部分，采用试剂盒提取基因组DNA，1一 SN/T 1908—2007测定含量后,稀释至0.1 μg/mL，一20℃保存备用。3.3.4商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。3.3.5低熔点琼脂糖。3.3.6液氮。4主要仪器和设备4.1荧光PCR仪。4.2高速冷冻离心机。4.3低速大容量离心机。4.4液氮罐。4.5生物显微镜及体视显微镜。4.6旋涡混匀器。4.7冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）。4.8麦克马斯特（McMaster)虫卵计数板。4.9微量可调移液器(0.1μL～2μL、2 μL～20 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL 等规格)和相应配套的吸头。4.1040 目金属网筛（孔径0.2 mm～0.3 mm）。4.11天平。4.12三角瓶、镊子、胶头滴管、载玻片、盖玻片等。15制样除非另有约定，本标准涉及的制样过程般包括混合足够量的送检份样组成原始样品，缩分原始样品得到试样和存查样品。1将原始样品倒在制样盘（如白色塘瓷盘)内，充分混合均匀，摊平样品。以对角线四分法缩分出试样和存查样品，每份样品质量约500g～1000g。应采用规格适宜的容器或包装袋盛装样品并密封。1检测样品存查量应至少满足一次检测所需。存查样品的保存条件应依据样品特性确定，为避免样品发生变化以及交叉污染，一般将存查样品密封保存于0℃～4℃，妥善保留3个月。6寄生虫卵分离6.1 洗脱取样品200g，泡菜（含液汁）等枝叶类样品放人大烧杯内，用1.0L0.5%SDS溶液分3次充分清洗每个叶片，合并洗脱液备用；辣椒酱等流体样品可不进行洗脱，直接进行过滤处理。16.2过滤将洗脱液用40目筛过滤，并用去离子水清洗筛网上的杂物，留取滤液备用。6.3离心将滤液1500r/min离心10min，小心倒去上清液，加人去离子水洗涤、1500r/min离心10min，2次，取沉淀备用。6.4　漂浮1在沉淀物中加人5倍体积的饱和氯化钠溶液，在旋涡混匀器上混匀，