NY_T 1949-2010隐孢子虫卵囊检测技术 改良抗酸染色法.pdf

ICS 11.220B 41中华人民共和国农业行业标准NY/T 1949—2010改良抗酸染色法隐孢子虫卵囊检测技术Modified acid-fast staining technique for detection ofCryptosporidium spp oocysts2010-12-01实施2010-09-21 发布中华人民共和国农业部5发布 NY/T 1949—2010言前本标准遵照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC 181)归口。本标准起草单位：南京农业大学、中国农业科学院上海兽医研究所。本标准起草人：黄克和、陈甫、陈兆国。一 NY/T 1949—2010隐孢子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法1 范围本标准规定了改良抗酸染色法（MAFS)检测隐孢子虫卵囊的操作技术和结果判定要求本标准适用于猪、牛、羊、兔、犬、鸡和鸭等动物（新鲜粪便样品或直肠采样)隐孢子虫感染的诊断与流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求中华人民共和国国务院令2004年第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》农业部公告2003年第302号《兽医实验室生物安全管理规范》3试剂和器械3.1 试剂3.1.1牛血清，20℃保存。3.1.2隐孢子虫卵囊，2.5%重铬酸钾溶液中4℃保存。3.1.3饱和蔗糖漂浮液或饱和盐水（见附录A）。3.1.4改良抗酸染色液（见附录A)。3. 1.5 0.1 mol/ L PBS(见附录 A)。3.1.65%重铬酸钾溶液（见附录A)。3.1.710%硫酸(见附录A)。3.1.8 香柏油、二甲苯。3.2器械3.2.1普通生物显微镜。3.2.2漩涡混匀器。3.2.3微量移液器:5 μL、200μL、1000 μL。3.2.4微量移液器头若干。3. 2.5载玻片及盖玻片若干。3. 2. 6离心机（最高转速5000 r/min，最大相对离心力3000g)与离心管（20mL、50mL，带盖）。4卵囊浓集与涂片4.1样品的保存和运送(见附录B)4.2卵囊浓集法4.2.1饱和蔗糖溶液漂浮法 穿上防护服,戴上一次性手套。取1g～2g待检样品(如成形的粪便,包括粪便表面的和内部的部分;如粪便是液体,可以混匀后取1mL～2 mL加人试管)加 40 mL PBS,研磨后经80 目铜筛过滤1 NY/T 1949--2010后，放入50mL试管中混匀，1500g离心10min。沉淀再用PBS洗涤一次,弃上清。向沉淀中加人10 mL饱和蔗糖溶液,加入 20 mL试管中，混匀,平衡后静置 10 min,置于离心管,放入离心机中,1500g离心10 min。离心机停下后，缓慢拿出离心管，小心取出上清液，加入带盖的50mL试管中，再加人40mLPBS,混匀，1500g离心10min。沉淀再用PBS洗涤次，沉淀加人20μLPBS混匀，待涂片用（室温）。4.2.2饱和盐水漂浮法　粪便的过滤、离心同。向沉淀中加人15mL饱和盐水，混匀,加入到20mL试管中,平衡后静置10 min，置于离心管放人离心机中,500g离心10 min。离心机停下后，缓慢拿出离心管，小心取出上清液，加人100mL试管中与80mL蒸馏水混匀,1500g离心10 min。沉淀加80mL蒸馏水混匀,放人100 mL试管中混匀,1500g离心10min。沉淀加人 20μL PBS 混匀,待涂片用。4.3涂片制备4.3.1每个载玻片均用铅笔进行标记,每个样品涂 2个载玻片。在载玻片中心滴加约3μL～5μL牛血清。4.3.2取经上述方法获得的浓集液10μL滴于载玻片上与牛血清混匀，涂成直径大小为1cm的圆，晾干。涂片过程中确保涂片是厚度均一、透明度一致。也可不进行卵囊浓集，用新鲜粪便样品直接涂片。4.3.3在室温下晾于干燥，火焰固定，置人乙醚中 3min去脂，晾干,置人甲醇中固定 3min（甲醇固定的涂片在室温下晾干后可存放6个月）。注:采用密度较大的液体,将卵囊漂浮在液体的上层而将卵囊集中起来,进而将卵囊从液体表面分离出来的方法称为卵囊浓集。因为卵囊的形态对于诊断具有重要意义，所以漂浮液不能仅仅具有密度大的特点，还必须保证卵囊在其中不会变形(涨大或皱缩）。饱和蔗糖溶液和饱和盐水都适合浓集隐孢子虫卵囊。5 染色5. 1用改良抗酸染色甲液染 2 min～5 min,蒸馏水或自来水冲洗后甩干。5.2在10%硫酸中脱色 30 s~60 s，蒸馏水或自来水冲洗，再脱色，反复至涂片不再返色。5.3用改良抗酸染色乙液染5min,蒸馏水或自